超微茶粉和糯米粉對(duì)豬肉肌原纖維蛋白乳化特性的影響

孫克奎，姜雪娟，潘雅燕，縱心想，熊國遠(yuǎn)*，周希

1(黃山學(xué)院 旅游學(xué)院，安徽 黃山，245021)2(安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)是組成肌肉中肌纖維的一種重要的蛋白質(zhì)，約占肌肉中總蛋白質(zhì)的50%～55%，其在影響加工肉制品質(zhì)量方面起著關(guān)鍵作用[1]。對(duì)于肉類產(chǎn)品來說，它對(duì)肉制品獨(dú)特的風(fēng)味和感官特性有重要影響[2]。國內(nèi)外很多學(xué)者主要針對(duì)添加外源性物質(zhì)改變MP功能特性的影響展開相關(guān)研究。袁程程等[3]將沙蒿膠加入蝦蛄肌原纖維蛋白中，研究報(bào)道了適當(dāng)添加沙蒿膠有利于提高M(jìn)P的乳化特性和理化性質(zhì)；楊明等[4]將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和馬鈴薯淀粉加入鯉魚肌原纖維蛋白中，研究表明兩者均能改善MP的功能特性；賈娜等[5]向豬肉肌原纖維蛋白中加入食用膠，研究發(fā)現(xiàn)食用膠均可顯著提高M(jìn)P的乳化能力、凝膠硬度和彈性以及保水性，且添加量越高，增加的幅度越大；但添加食用膠后，肌原纖維蛋白的凝膠白度略有下降。ZHUANG等[6]將甘蔗膳食纖維加入到MP中研究報(bào)道了甘蔗膳食纖維可以提高M(jìn)P凝膠的功能特性等，尋找并通過外源物質(zhì)的添加不僅能改善MP的加工特性，而且對(duì)于開發(fā)新型功能食品也具有重要意義。

茶葉中含有很多功能成分，如茶多酚、茶多糖、維生素等，國內(nèi)有一些關(guān)于茶多酚在肉制品中的報(bào)道，如馬嫄等[7]在午餐肉中分別添加一定量的茶多酚和TBHQ，研究報(bào)道了不同添加量茶多酚處理的午餐肉均有較好的抗氧化效果。XIONG等[8]向肉中加入綠茶提取物，研究發(fā)現(xiàn)茶提取物的抗氧化能力是由于其含有高含量的兒茶素、單寧等黃酮類化合物。梁進(jìn)等[9]將茶多酚和納米茶多酚加入瘤株小鼠體內(nèi)，研究報(bào)道了納米茶多酚對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并呈劑量與時(shí)效關(guān)系。但大多是茶中活性成分的利用，但茶粉對(duì)肉制品的影響還未見報(bào)道，且茶粉中纖維素含量高，市場(chǎng)上廢茶碎茶多，研究茶粉對(duì)MP的功能特性影響，這對(duì)茶粉在肉制品中的應(yīng)用起重要的指導(dǎo)意義。糯米粉中主要成分是支鏈淀粉，淀粉是人體攝入能量的主要來源，由于其價(jià)格低、天然可再生，同時(shí)又是優(yōu)良的增稠劑，因而被廣泛運(yùn)用到食品工業(yè)中。YI等[10]將糯米粉添加進(jìn)牛肉餅中，研究表明糯米粉能有效改善牛肉餅的理化性能和感官特性。GAO等[11]研究了糯米粉對(duì)豬肉餅品質(zhì)的影響，研究表明添加3%的糯米粉的豬肉餅品質(zhì)更好。但糯米粉對(duì)MP乳化特性的研究還未見報(bào)道。

本研究旨在評(píng)估超微茶粉和糯米粉對(duì)肌原纖維蛋白乳化特性的影響，研究不同質(zhì)量濃度TP和GRF對(duì)MP乳化活性(emulsion activity index, EAI)、乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index, ESI)、起泡性(foaming ability, FA)、起泡穩(wěn)定性(foaming stability, FS)乳化液粒度和分布、乳化液微觀的影響，以期對(duì)超微茶粉和糯米粉在肉與肉制品中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和參考，也為開發(fā)新型功能肉制品提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料及主要試劑

(1)原料

普通綠茶,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院提供;糯米粉,淮南市新食客食品有限公司;金龍魚牌大豆油,益海嘉里糧油有限公司;普通豬瘦肉,購于大潤發(fā)超市。

(2)主要試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、牛血清蛋白、CuSO4，酒石酸鉀鈉、NaOH、十二烷基磺酸鈉(SDS)、尼羅藍(lán)、尼羅紅、卡爾科弗盧爾熒光增白劑、異丙醇,以上試劑均為分析純。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器

GZX-9070 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Ultra Turrax T-25 Basic 高速分散器，德國IKA公司；LSM800 激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司有限公司；Masterizer2000 激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Beckman Avanti J-E 離心機(jī)，美國Beckman coulter公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IKA C-MAG HS7 磁力攪拌器，德國IKA公司；PE Lambda35紫外可見分光光度計(jì)，力臻卓越科學(xué)儀器有限公司；JA503 分析電子天平，常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；YXQM-1L系列行星球磨機(jī)，長(zhǎng)沙米淇?jī)x器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的制備

(1)MP的提取

參照 PARK等[12]，并稍作修改。將豬肉剔除筋膜后充分?jǐn)厮橹寥饷訝睿尤?倍體積的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.5)，緩沖溶液濃度為0.02 mol/L，肉漿在10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下用高速分散器勻漿1 min，勻漿液在4 ℃下于冷凍離心機(jī)內(nèi)以7 800 r/min 的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄上清液，向沉淀中加入4倍體積磷酸鹽緩沖液離心，重復(fù)3次，得到粗MP。然后向粗MP中加入4倍體積的0.1 mol/L的NaCl 溶液，再勻漿離心1次，用冰洗液沖洗得到的沉淀，4層紗布過濾，濾液再次進(jìn)行離心，離心后的沉淀即是MP。提取的MP用4 ℃的冰箱儲(chǔ)存，以備后續(xù)使用。實(shí)驗(yàn)過程溫度保持在4 ℃左右。

(2)超微茶粉的制備[13]

利用球磨機(jī)生產(chǎn)超微茶粉的工藝，將茶葉于40 ℃干燥，再用小型家用粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉碎，過40目篩。將所得到的粗顆粒進(jìn)球磨機(jī)(球磨機(jī)公轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速為400 r/min，粉碎時(shí)間為40 min)，得到的超微茶粉用粒度儀測(cè)定其平均粒徑為13.8 μm。

1.2.2 肌原纖維蛋白濃度的測(cè)定

用雙縮脲法測(cè)定[14]：用牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清蛋白溶解，配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.046 7x-0.004 1；R2=0.999 4。隨后取1 g蛋白溶于25 mL磷酸鹽緩沖鹽，取3個(gè)試管分別加入1 mL樣品溶液，加入4 mL雙縮脲試劑，充分搖勻后在室溫下放置30 min，于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。

1.2.3 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

(1)混合溶液的配制

將MP用0.6 mol/L NaCl溶液(pH=6.5)配制成1 mg/mL溶液。添加不同質(zhì)量濃度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液中，攪拌至均勻形成混合溶液。

(2)參考AGYARE等[15]的方法，并稍作修改，采用濁度法。將大豆油與MP混合溶液以1∶4的比例加到燒杯中，使用高速分散器高速勻漿1 min(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)，立即從杯底0.5 cm處取出100 μL勻漿，加入5 mL 0.1% SDS溶液的試管中并進(jìn)行振蕩(SDS的添加是為了防止乳化后聚集體的形成)，混合均勻。測(cè)定其在500 nm處的吸光值，記為A0。10 min后，用相同方法再次于500 nm處測(cè)定其吸光值，記為A10。

MP溶液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性可通過公式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算:

(1)

(2)

式中：A500表示樣品在500 nm處的吸光值；ψ表示樣品中油相的體積分?jǐn)?shù)(ψ=0.25)；C表示蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度；A0和A10分別表示0 min和10 min取得的樣品的吸光值。

1.2.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參考OGUNWOLU等[16]的方法，并有所修改。將MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液，配制成5 mg/mL的蛋白溶液，然后添加不同質(zhì)量濃度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液，室溫下磁力攪拌30 min形成混合溶液。取20 mL溶液于100 mL量筒中，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下勻漿1 min。立刻讀取泡沫的總體積，記為V0,靜置30 min后再次讀取泡沫體積，記為V30。起泡性和起泡穩(wěn)定性可通過公式(3)和(4)進(jìn)行計(jì)算:

(3)

(4)

式中：V表示MP溶液的體積,mL；V0和V30分別表示均質(zhì)后和靜置30 min以后讀取的體積,mL。

1.2.5 乳化液粒度和分布測(cè)定

乳化液的制備[17]：乳化液由MP、水、大豆油、不同添加量的茶粉和糯米粉制備(按質(zhì)量比例，加入2%的MP，30%的大豆油，0.05%、0.10%、0.15%超微茶粉，0.30%、0.40%、0.50%糯米粉)。將MP與去離子水以1∶8的比例混合，并于室溫下用磁力攪拌器攪拌3 h，制成均勻的混合蛋白溶液，然后在4 ℃下保存24h以備使用。制備好的蛋白溶液中加入大豆油并用高速分散器在15 000 r/min條件下均質(zhì)90 s(冰浴)制成預(yù)乳化液，再向預(yù)乳化液加入水和相應(yīng)添加量的茶粉和糯米粉，在10 000 r/min條件下均質(zhì)90 s(冰浴)。

乳化液粒徑的測(cè)定：通過 Masterizer2000激光粒度儀測(cè)定乳化液中油滴平均直徑的大小。分散相為水，采用濕法進(jìn)樣模式，顆粒的折射率為1.436，吸收率為0.001。

1.2.6 乳化液微觀觀察

通過激光共聚焦顯微鏡觀察乳化液中蛋白質(zhì)、油滴和多糖的分布情況。將80 μL 0.01%的尼羅紅染液(溶于異丙醇)、0.01%尼羅藍(lán)染液(溶于異丙醇)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑以1∶1∶1的體積比與1 mL上述制備的乳化液均勻混合，并立即滴加在單凹載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。樣品在3個(gè)激光束下被激發(fā)，尼羅紅在514 nm下被激發(fā)，尼羅藍(lán)在633 nm下被激發(fā)，熒光增白劑在405 nm下被激發(fā)。尼羅紅為油染料，尼羅藍(lán)為蛋白染料，卡爾科弗盧爾熒光增白劑為多糖染料[18]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)每組均采取3次重復(fù)，即n=3。采用軟件SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用ANOVA分析，多重比較采用Duncan法，P< 0.05表示差異顯著，用Origin軟件進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的乳化性能的關(guān)鍵指標(biāo)。EAI是指單位質(zhì)量蛋白質(zhì)在促進(jìn)油水互溶時(shí)，穩(wěn)定油水界面的大小，ESI是指維持油水混合不分離時(shí)，蛋白質(zhì)抵抗外界條件的能力。

圖1 茶粉和糯米粉對(duì)肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，TP添加量在0%～0.10%時(shí)，MP乳化活性逐漸提高，但TP添加量過大，乳化活性反而下降；TP添加量為0.10%，乳化活性達(dá)到最大值(22.02±2.02)m2/g；MP乳化活性隨著GRF增加而不斷提升，GRF添加量為0.50%，MP的乳化活性達(dá)到最大值(23.15±1.50)m2/g，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，可能因?yàn)椴璺壑械睦w維在油水界面形成了較厚的界面膜，使得液滴之間產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)從而阻礙了液滴聚集[19]；而茶粉固體顆粒之間相互纏結(jié)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在一定程度上增加了乳液的穩(wěn)定性。但加入過量TP會(huì)包裹蛋白質(zhì)表面活性基團(tuán)，使乳化膜厚度增大，導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳化活力降低[4]。糯米粉的添加，顯著提高M(jìn)P的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)聚集性，從而使MP的乳化活性增大[20]。

MP乳化穩(wěn)定性隨著TP(0%～0.05%)和GRF(0%～0.30%)添加量的增加而提高，TP添加量為0.05%，ESI達(dá)到最高值((89.6±4.02)%)，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；GRF添加量為0.30%，ESI達(dá)到最大值((80.1±3.6)%)，但與空白對(duì)照組沒有顯著差異(P>0.05)。可能是TP添加量適量上升，TP的纖維與MP相互結(jié)合，相互作用，形成二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻礙脂肪在體系中擴(kuò)散，使得乳化液的穩(wěn)定性能夠提升[21]；隨著TP添加量增大，乳化液微粒間距離變小，蛋白質(zhì)吸附層的黏著力減小，使得油滴聚集，穩(wěn)定性降低。這可能是因?yàn)榕疵追鄣奶砑釉黾恿梭w系的稠度，阻礙了油滴的聚集，提高了體系的乳化穩(wěn)定性[4]。當(dāng)添加量過多時(shí)，乳化液微粒粒度變大，使得油滴聚集，而且過多的淀粉易發(fā)生沉降而不能在溶液體系中起到作用[22]。

2.2 肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性

由圖2可知，TP添加量為0%～0.10%時(shí)，MP的起泡性逐漸提高，最高值為(23.3±2.3)%，顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)；當(dāng)TP添加量持續(xù)增加，MP起泡性逐漸降低。蛋白質(zhì)起泡性由蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散、界面張力及疏水基團(tuán)含量和分布等決定，TP添加量低，蛋白質(zhì)與多糖相互作用阻止氣泡粗化，溶解度上升，起泡性增強(qiáng)；但茶粉添加量過多會(huì)包裹蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)和水界面上的蛋白量較少導(dǎo)致起泡性的降低。GRF添加量為0%～0.50%時(shí)，MP的起泡性不斷增加，最高值為(29.0±2.0)%，且與對(duì)照組有顯著差異(P< 0.05)。蛋白起泡性的提高可能是因?yàn)樗心サ呐疵追酆写罅恐ф湹矸郏淙苡谒茉黾釉揗P的拉伸性，氣泡形成能力提高，糯米面粉中還含有一定量的蛋白質(zhì)，也使得起泡性增加[23]。

圖2 茶粉和糯米粉對(duì)肌原纖維蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

TP添加量為0.0%～0.05%時(shí)，MP起泡穩(wěn)定性逐漸增加，最高值為(78.0±4.6)%，較其他添加組有顯著差異(P< 0.05)。泡沫的穩(wěn)定性與蛋白的溶解性柔韌性等有關(guān)，起泡穩(wěn)定性提高可能因?yàn)榈吞砑恿縏P能改善蛋白的溶解性，但過多TP會(huì)降低蛋白之間的相互作用，使泡沫穩(wěn)定性降低[24]。MP的起泡穩(wěn)定性隨GRF添加量的增加而降低，與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。可能是體系的黏度隨著粒子濃度的增加而增加，阻礙了均質(zhì)過程中粒子的移動(dòng)以及在油水界面的吸附，并且淀粉的聚集作用使得蛋白泡沫發(fā)生聚集和破裂，從而使起泡穩(wěn)定性降低。

2.3 茶粉和糯米粉對(duì)肌原纖維蛋白乳化液粒徑的影響

由表1、表2和圖3、圖4可知，隨著TP添加量的增加乳化液粒度變小，TP添加量為0.15%時(shí)，液滴的粒度最小，此時(shí)平均粒度為(28.515 μm)。可能是由于多糖與蛋白質(zhì)的協(xié)同作用，與蛋白質(zhì)通過氫鍵作用和疏水作用在乳化體系中均勻分散開[25]。因?yàn)槎嗵菧p少了液滴和連續(xù)相之間的密度差異，能顯著改善連續(xù)相的黏度并使液滴的尺寸減小，使得乳化液更加穩(wěn)定。也可能是茶粉中的多酚導(dǎo)致乳化液顆粒變小，WANG等[25]發(fā)現(xiàn)α -乳清蛋白與 EGCG 共價(jià)結(jié)合能提高其抗氧化能力并降低了乳化液的粒徑。GRF添加量為0%～0.40%時(shí)，液滴平均粒度隨GRF添加量的增加而減小，但GRF添加量為0.50%時(shí)，粒度反而增大，可能是由于GRF過多，導(dǎo)致連續(xù)相中的多糖過多使得液滴之間的間隙變小，發(fā)生絮凝和沉淀等現(xiàn)象，吸附在液滴表層的蛋白被排擠出來，液滴凝集而使粒度增大。

圖3 茶粉對(duì)乳化液粒度的影響

圖4 糯米粉對(duì)乳化液粒度的影響

表1 添加茶粉的乳化液液滴平均粒度

注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。下同。

表2 添加糯米粉的乳化液液滴平均粒度

2.4 茶粉和糯米米粉對(duì)肌原纖維蛋白乳化液微觀狀態(tài)的影響

激光共聚焦顯微鏡是研究蛋白質(zhì)和多糖實(shí)際分布和相互作用的重要工具，成像顯示了肌原纖維蛋白、大豆油、茶粉和糯米粉在乳化液中的分布及相互作用。由圖5、圖6可知，脂肪顆粒多呈現(xiàn)球狀或者近似球狀，MP包裹在這些大小不一的脂肪球表面，使得乳化體系更加穩(wěn)定[27]。當(dāng)乳化液中不添加茶粉和糯米粉時(shí)，乳化液的液滴分布密集混亂，大小不一，隨著茶粉和糯米粉的添加，液滴分散且顆粒均逐漸變小，但茶粉對(duì)乳化液液滴大小的影響力更大。可能是外源性添加物中的多糖物質(zhì)與蛋白的協(xié)同作用，改善乳化液的黏度，吸附在油脂表面形成空間阻礙防止油滴聚集，從而使乳化體系穩(wěn)定。由圖6可知，由于GRF中支鏈淀粉含量高，支鏈淀粉與肉類蛋白的相互作用，隨著糯米粉添加量的增加，絮凝開始增加。這可能歸因于未吸附的淀粉引起的絮凝作用，導(dǎo)致高添加量糯米粉增加了乳液粒度。

a-CK；b-0.05%TP；c-0.1%TP；d-0.15%TP

a-CK；b-0.30%GRF；c-0.40%GRF；d-0.50%GRF

3 結(jié)論

研究表明，適當(dāng)TP和GRF的添加可以改善MP的乳化特性。與對(duì)照組相比，添加0.05%、0.10%的TP，能夠提高蛋白的乳化活性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性，但加入量過高，反而會(huì)使蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都降低。而糯米粉中含有大量支鏈淀粉，提升了蛋白的持水能力和保油能力，易形成穩(wěn)定的乳化體系，因此添加了GRF的蛋白乳化活性和起泡性都有所提高。從乳化液的微觀結(jié)構(gòu)可看出，TP和GRF會(huì)使液滴的粒度減小，分布更加均勻，因此乳化體系更加穩(wěn)定。總的來說，向肌原纖維蛋白中添加適量的TP和GRF，肌原纖維蛋白的乳化特性得到改善；因此，TP和GRF在乳化肉制品加工中有較好的應(yīng)用前景，對(duì)生產(chǎn)新型功能性乳化性肉制品提供了較好的思路。