紅曲紅添加量對(duì)豬肉肌原纖維蛋白功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響

李懿璇，王悅，魯小川，康夢(mèng)瑤，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716)2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400716)3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

亞硝酸鹽是常用的肉制品的發(fā)色劑，除了發(fā)色外，還具有抑菌、抗氧化、改善肉制品風(fēng)味和品質(zhì)等功效。但大量研究表明，產(chǎn)品中殘留的亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的致癌作用[1-3]，減少亞硝酸鹽的使用、降低其殘留量一直以來都是肉類科學(xué)研究的重要課題。目前，減少肉制品中亞硝酸鹽含量的方法主要有以下幾種：(1)減少亞硝酸鹽用量；(2)在不改變亞硝酸鹽用量的前提下，加入能夠阻斷亞硝胺形成的添加劑；(3)使用由著色劑、抗氧化劑、多價(jià)鰲合劑和抑菌劑等混合組成的添加劑來部分或完全替代亞硝酸鹽。

紅曲紅色素作為紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，不僅有良好的著色性能，而且安全性高，還具有抑菌等生理活性[4-7]。李燕萍等[8]發(fā)現(xiàn)添加紅曲紅能增加肉制品中氨基酸含量，賦予食品良好的風(fēng)味。因此，紅曲紅已經(jīng)成為發(fā)色劑替代研究中的重要材料。

MP是豬肌肉中重要的鹽溶蛋白，約占其總蛋白的55%左右，對(duì)肉制品的持水、乳化和凝膠等功能特性具有重要作用，決定著肉制品的嫩度、質(zhì)地、黏彈和咀嚼等食用性質(zhì)[9]。MP在加工過程中容易被氧化、降解和發(fā)生變性，亞硝酸鹽對(duì)MP的功能特性具有一定的保護(hù)作用[10-11]，亞硝酸鹽被替代或部分替代可能對(duì)MP的功能性質(zhì)和產(chǎn)品品質(zhì)帶來不良的影響，但此類研究目前還處于起步階段。本文以豬背最長(zhǎng)肌為原料，研究低硝腌制條件下適量添加紅曲紅對(duì)豬肉MP功能性質(zhì)的變化、探討其變化機(jī)理，以期為高質(zhì)量低硝肉制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌，購(gòu)于北碚區(qū)天生農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)宰后約4 h內(nèi)的原料肉，放在帶冰袋的保濕箱中，在20 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；紅曲紅,食品級(jí)(色價(jià)為100)，成都市科龍化工試劑廠;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-10高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MCR302 流變儀，奧地利安東帕公司；SYNERGYH1MG全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)基因公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣處理

用消毒過的砧板和刀具在無菌操作臺(tái)上將原料去除脂肪和結(jié)締組織后分割成200 g左右塊狀，自封袋包裝后于-20℃凍藏備用，使用前4 ℃解凍12 h。

將豬背最長(zhǎng)肌與腌制液按質(zhì)量比1∶1混合，于4℃腌制72 h后提取MP進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。對(duì)照組腌制液配制,亞硝酸鈉含量為肉重的0.01%，食鹽2%；實(shí)驗(yàn)組,亞硝酸鈉含量為肉重的0.005%，食鹽2%，紅曲紅添加量分別為肉重的0%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%。

1.3.2 MP的提取及濃度的測(cè)定

參照HONG等[12]的方法。

1.3.3 溶解度的測(cè)定

參照KUNARAYAKUL等[13]的方法并修改。將配好的2.5 mg/mL MP溶液于4 ℃靜置1 h，冷凍離心(5 500 r/min， 4 ℃，15 min)后取上清液，其濃度用雙縮脲法測(cè)定，用磷酸緩沖液代替空白。按公式(1)計(jì)算MP的溶解度。

(1)

1.3.4 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照AGYARE等[14]的方法測(cè)定。

1.3.5 蛋白流變學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

參照AMIRI等[15]的方法并修改。調(diào)整MP質(zhì)量濃度為40 mg/mL的溶液，4℃的條件下2 800 r/min分散均勻后反應(yīng)1 h。測(cè)定參數(shù)夾具改為40 mm，為了避免在加熱過程中蒸干樣品，應(yīng)先擦干外露的樣品，然后用凡士林將其密封起來。

1.3.6 蛋白羰基含量的測(cè)定

參照TOKUR等[16]的方法測(cè)定。

1.3.7 蛋白巰基含量的測(cè)定

參照YONGSAWATDIGUL等[17]的方法并修改。配制試樣濃度為4 mg/mL，取1 mL MP溶液加入9 mL 0.02 mol/L緩沖溶液C(10 mmol/L EDTA，0.6 mol/L KCl與8 mol/L尿素，pH 7.0)，2 800 r/min勻漿30 s。將0.1 %的DTNB 0.4 mL加入到4 mL混勻液中，對(duì)照組為10 mL緩沖液C與0.4 mL 0.1%的DTNB，在水浴鍋中保溫 (25 min，40 ℃)，于412 nm處測(cè)定吸光值。總巰基含量按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：A，吸光值，nm；ε，吸光系數(shù)，13 600 mol/(cm·L)；D，稀釋倍數(shù)；C，上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.8 表面疏水性的測(cè)定

參照CHELH等[18]的方法并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。用磷酸鹽緩沖液配制MP溶液濃度為5 mg/mL。室溫振蕩裝有樣液1 mL和質(zhì)量濃度為1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液200 μL的離心管10 min，使其混合均勻后離心10 min(8 000 r/min)。將其1 mL上清液與9 mL磷酸鹽緩沖液混合稀釋10倍，于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)，用磷酸鹽緩沖液代替空白，表面疏水性按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：A0，空白對(duì)照組的吸光度值，nm；A1，MP溶液的吸光度值，nm。

1.3.9 SDS-PAGE分析

參照LAEMMLI[19]的方法測(cè)定。

1.3.10 紅外光譜分析

參照林婉玲等[20]的方法并修改。取凍干后的MP試樣3 mg與200 mg干燥的溴化鉀(105℃烘箱中干燥48 h)置于瑪瑙研缽中，充分研磨后，裝樣，手動(dòng)壓片。采用紅外光譜儀Spectrun100進(jìn)行測(cè)定，掃描24 次，分辨率為4 cm-1作為測(cè)定條件。用Peakfit 4.12對(duì)所得的圖譜進(jìn)行去卷積和曲線擬合分析。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，用Excel處理數(shù)據(jù)，SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Origin 8.5繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲紅添加量對(duì)MP功能特性的影響

2.1.1 表面溶解度的變化

蛋白質(zhì)的溶解性作為蛋白質(zhì)功能特性的重要指標(biāo)，與其乳化性、表面疏水性、凝膠特性等其他特點(diǎn)關(guān)系密切，這些關(guān)系特征只有在蛋白質(zhì)高度溶解時(shí)才出現(xiàn)，對(duì)肉制品加工有著重要意義。紅曲紅添加量對(duì)MP溶解度的影響如圖1所示。紅曲紅添加量增加，MP溶解度呈先增大后減小的趨勢(shì)。添加紅曲紅后各處理組的溶解度均顯著大于紅曲紅添加量為0時(shí)的溶解度(P<0.05)，且在紅曲紅添加量為0.15%時(shí)出現(xiàn)峰值，表明在較低亞硝酸鈉添加量條件下添加紅曲紅仍可以提高M(jìn)P的溶解度，改善蛋白質(zhì)的功能特性。紅曲紅添加量從0增加至0.15%時(shí)，溶解度從29.26%增加到47.67%，溶解度增大了18.41%，可能是由于紅曲紅分子結(jié)構(gòu)中具有羰基、氨基、羥基、羧基等極性基團(tuán)，當(dāng)其添加至蛋白溶液后體系中極性和非極性殘基的電荷平衡發(fā)生改變，在靜電斥力的作用下促進(jìn)了蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用，從而使蛋白質(zhì)的溶解度增加[21]。同時(shí)反映紅曲紅本身可能具有一定的抗氧化性質(zhì)，抑制了腌制過程中因蛋白質(zhì)氧化而導(dǎo)致的溶解度的降低。在紅曲紅添加量從0.15%增大至0.2%時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度明顯下降(P<0.05)，當(dāng)紅曲紅添加量進(jìn)一步增大時(shí)，較0.2%的蛋白樣品相比溶解度變化不明顯(P>0.05)，這可能是紅曲紅添加量過高，紅曲紅分子結(jié)構(gòu)中的羰基等極性基團(tuán)與蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，通過疏水相互作用促使蛋白質(zhì)周圍的水分子發(fā)生了重排，減小了蛋白質(zhì)與水分子之間的結(jié)合作用，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚，降低了溶解度。

圖1 紅曲紅添加量對(duì)MP溶解度的影響

2.1.2 乳化性的變化

乳化性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)保持乳化體系油水界面能力的重要指標(biāo)[22]。紅曲紅添加量對(duì)MP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖2所示。紅曲紅添加量增加，MP的乳化活力指數(shù)(EAI，emulsfication activity index)值和乳化穩(wěn)定性(ESI，endsystem idenifier)值均呈先增大后減小的趨勢(shì)。在紅曲紅添加量小于0.15%時(shí)，ESI值及其EAI值都先增大后減小。隨著紅曲紅添加量的增大顯著增大(P<0.05)；在紅曲紅濃度為0.15%時(shí)，EAI值和ESI值都出現(xiàn)峰值，即乳化效果最好，與紅曲紅添加量為0時(shí)相比，EAI值增大了77.68%，ESI值增大了37.22%；在紅曲紅添加量大于0.15%時(shí)，EAI值和ESI值均顯著降低(P<0.05)。添加紅曲紅后各處理組的EAI值和ESI值均顯著大于紅曲紅添加量為0時(shí)的EAI值和ESI值(P<0.05)，表明在亞硝酸鈉含量較低時(shí)間添加紅曲紅仍可以提高M(jìn)P的乳化性，改善蛋白質(zhì)的功能特性。而當(dāng)紅曲紅繼續(xù)增加時(shí)，EAI值和ESI值均顯著降低(P<0.05)，這可能是當(dāng)紅曲紅過量時(shí)蛋白質(zhì)與水分子之間的靜電斥力會(huì)被破壞，使得脂肪球大量聚集，產(chǎn)生油水分離的現(xiàn)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的乳化性能降低。與未添加紅曲紅、亞硝酸鈉含量較高的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)的EAI值和ESI值與其接近(P>0.05)；添加0.15%紅曲紅時(shí)的EAI值和ESI值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明添加適量紅曲紅可以顯著提高M(jìn)P的乳化性能，這對(duì)提高肉在加工過程中維系脂肪的能力、降低損失及改善產(chǎn)品品質(zhì)是有益的。

圖2 紅曲紅添加量對(duì)MP乳化性的影響

2.1.3 流變性質(zhì)分析

肉制品的口感、質(zhì)構(gòu)及其風(fēng)味與其黏彈性即流變性密切相關(guān)。在加熱過程中，MP蛋白質(zhì)分子性質(zhì)和形態(tài)的變化可由MP的動(dòng)態(tài)流變學(xué)性質(zhì)可以表現(xiàn)出來，儲(chǔ)能模量(storage modulus，G′)是衡量蛋白質(zhì)凝膠能力的一個(gè)重要指標(biāo)，能夠反映出不同溫度下蛋白質(zhì)的展開和聚集過程，蛋白質(zhì)凝膠能力越強(qiáng)，G′值越高[23]。

紅曲紅添加量對(duì)MP流變學(xué)性質(zhì)的影響變化如圖3所示。紅曲紅和空白對(duì)照組、處理組豬肉MP的G′值大體上呈先緩慢上升后下降再顯著上升最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，0%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%紅曲紅處理組和對(duì)照組MP 的G′最大值分別為41 100.1、59 532、413 128.4、305 216.3、136 287.7和263 567 Pa。第一階段，首先隨著溫度不斷升高，G′值緩慢增大，在44～47 ℃下出現(xiàn)首次峰值，這主要是因?yàn)榧∏虻鞍捉Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)，初步形成了較弱的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；第二階段是隨著溫度的升高，G′值逐漸減小，在50～52 ℃時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)峰值，隨著維持網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的氫鍵在加熱過程中大量斷裂，蛋白質(zhì)開始發(fā)生變性，肌球蛋白尾部的螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，破壞了已形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致凝膠弱化；第三階段是隨著溫度的升高，G′值迅速增大最后趨于穩(wěn)定，在69～75 ℃時(shí)出現(xiàn)第3個(gè)峰值，這主要是因?yàn)樵诙蜴I和疏水相互作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或凝聚，最終形成了穩(wěn)定的、不可逆的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠[24]。添加紅曲紅后各處理組G′的最大值均顯著大于紅曲紅含量為%0時(shí)G′的最大值(P<0.05)，表明在較低亞硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下添加紅曲紅仍可以提高M(jìn)P的凝膠能力，抑制蛋白質(zhì)的變性和降解。與未添加紅曲紅、含有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)亞硝酸鈉的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)G′的最大值與其接近(P>0.05)，而紅曲紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%時(shí)G′的最大值明顯較高(P<0.05)。表明適量添加紅曲紅可以顯著提高M(jìn)P的凝膠能力，進(jìn)而可以提高肉制品品質(zhì)。

圖3 紅曲紅添加量對(duì)MP凝膠彈性的影響

2.2 紅曲紅添加量對(duì)MP結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 羰基含量的變化

羰基常通過直接氧化氨基酸側(cè)鏈、結(jié)合非蛋白羰基化合物、與還原糖反應(yīng)和肽骨架斷裂等方式產(chǎn)生，其含量可反映出蛋白質(zhì)的氧化程度[25]。紅曲紅添加量對(duì)MP羰基含量的影響如圖4所示。隨著紅曲紅添加量的不斷增大，羰基含量呈先減小后增大的趨勢(shì)。當(dāng)添加量為0.15%時(shí)，羰基含量顯著降低達(dá)到最小值3.03 nmol/mg蛋白質(zhì)(P<0.05)，與紅曲紅添加量為0時(shí)相比減少了57.8%，可能是因?yàn)榧t曲紅分子結(jié)構(gòu)中的羰基等極性基團(tuán)與蛋白質(zhì)相互作用，降低了氨基酸側(cè)鏈被氧化的程度，使得羰基含量減少。當(dāng)紅曲紅添加量大于0.15%時(shí)，其含量反而明顯增高(P<0.05)，可能是因?yàn)榧t曲紅添加量過高，造成蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步變性。添加紅曲紅后各處理組的羰基含量均顯著小于紅曲紅添加量為0時(shí)的羰基含量(P<0.05)，表明在較低亞硝酸鈉含量條件下添加紅曲紅仍可以降低MP的羰基含量，抑制MP氧化變性。與未添加紅曲紅、較高含量亞硝酸鈉的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)的羰基含量與其接近(P>0.05)，添加0.15%紅曲紅時(shí)的羰基含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。表明適量添加紅曲紅可以顯著降低MP的巰基含量，使MP的氧化變性和降解得到扼止，進(jìn)而可以提高肉制品品質(zhì)。

圖4 紅曲紅添加量對(duì)MP羰基含量的影響

2.2.2 巰基含量的變化

巰基基團(tuán)是MP中最活潑、最具反應(yīng)活性的功能基團(tuán)，對(duì)于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有重要意義，當(dāng)MP變性后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致巰基暴露，容易被氧化形成二硫鍵，使MP中巰基含量減少。巰基含量的變化可以顯示出蛋白質(zhì)氧化變性的水平，也關(guān)乎著其功能特性[26]。紅曲紅添加量對(duì)MP巰基含量的影響如圖5所示。隨著紅曲紅添加量的不斷增大，MP的巰基含量呈先增大后減小的趨勢(shì)。在紅曲紅添加量增加至0.15%時(shí)巰基含量達(dá)到最大值7.73×10-5mol/g蛋白質(zhì)，比紅曲紅添加量為0%時(shí)的巰基含量增大了42.1%，這可能是由于紅曲紅添加至蛋白溶液后體系的電荷平衡發(fā)生改變，蛋白質(zhì)分子變性展開，使得分子內(nèi)部的巰基部分暴露出來，巰基含量增加，以及紅曲紅本身可能就具有一定的抗氧化能力。隨著紅曲紅添加量的進(jìn)一步增大，巰基含量明顯減小(P<0.05)，這可能是因?yàn)榧t曲紅添加量過高時(shí)，紅曲紅分子結(jié)構(gòu)中的羰基等極性基團(tuán)與蛋白質(zhì)相互作用，使巰基含量下降。添加紅曲紅后各處理組的巰基含量均顯著大于紅曲紅添加量為0時(shí)的巰基含量(P<0.05)，表明在較低亞硝酸鈉含量條件下添加紅曲紅仍可以提高M(jìn)P的巰基含量，抑制MP氧化變性。與未添加紅曲紅、亞硝酸鈉含量較高的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)的巰基含量與其接近(P>0.05)，而添加0.15%紅曲紅時(shí)的巰基含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表明用適量添加紅曲紅可以顯著提高M(jìn)P的巰基含量，對(duì)MP的氧化變性和降解有更有效的抑制作用。

圖5 紅曲紅添加量對(duì)MP巰基含量的影響

2.2.3 表面疏水性的變化

蛋白分子表面存在疏水性氨基酸，它的相對(duì)含量反映蛋白質(zhì)表面的疏水性，表面疏水性基團(tuán)暴露數(shù)量與蛋白質(zhì)的疏水性成正比關(guān)系，MP的蛋白分子聚集在一起，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性，因此蛋白質(zhì)的變性程度可以用表面疏水性來衡量[27-28]。溴酚藍(lán)可以與蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)相結(jié)合，因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)與溴酚藍(lán)的結(jié)合量來測(cè)定表面疏水性[29]。

紅曲紅添加量對(duì)MP表面疏水性的影響如圖6所示。隨著紅曲紅添加量的不斷增大，溴酚藍(lán)含量呈先減小后增大的趨勢(shì)。當(dāng)紅曲紅添加量為0.15%時(shí)，溴酚藍(lán)含量顯著降低達(dá)到最小值17.59 μg(P<0.05)，與紅曲紅添加量為0%時(shí)相比減少了11.89 μg，可能是因?yàn)榧t曲紅的加入促進(jìn)了蛋白質(zhì)與水分子之間的締合作用，疏水性基團(tuán)暴露得較少，降低了溴酚藍(lán)含量[30]；另一方面與蛋白發(fā)生疏水相互作用可能會(huì)導(dǎo)致疏水基團(tuán)的掩蔽。當(dāng)紅曲紅添加量大于0.15%時(shí)，溴酚藍(lán)含量呈上升趨勢(shì)(P<0.05)，這可能是因?yàn)樘砑拥募t曲紅添加量較高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)里的α-螺旋含量、無規(guī)卷曲含量發(fā)生變化，α-螺旋含量呈下降趨勢(shì)，無規(guī)卷曲含量持續(xù)增加，蛋白分子結(jié)構(gòu)的逐漸展開造成包埋在分子內(nèi)的疏水性基團(tuán)逐漸大量暴露出來，增加了溴酚藍(lán)含量[31]。MP與溴酚藍(lán)的結(jié)合程度表明疏水性強(qiáng)弱，兩者成正比關(guān)系，疏水性越強(qiáng)，MP的變性程度越大。添加紅曲紅后各處理組的溴酚藍(lán)含量均顯著小于紅曲紅添加量為0時(shí)的溴酚藍(lán)含量(P<0.05)，表明在亞硝酸鈉含量較低時(shí)添加紅曲紅仍可以降低MP的表面疏水性，從而抑制蛋白質(zhì)變性，使其功能特性得到改善。與未添加紅曲紅、亞硝酸鈉含量較高的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.15%紅曲紅時(shí)的溴酚藍(lán)含量與其接近(P>0.05)，表明用適量添加紅曲紅不會(huì)對(duì)MP的表面疏水性產(chǎn)生顯著影響。

圖6 紅曲紅添加量對(duì)MP表面疏水性的影響

2.2.4 SDS-PAGE分析

MP由多種蛋白質(zhì)構(gòu)成，在蛋白溶液樣品中加入不同濃度的紅曲紅后其電泳條帶的變化會(huì)有所不同。紅曲紅部分替代亞硝酸鈉對(duì)MP的SDS-PAGE圖譜的影響如圖7所示。通常，蛋白質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物就是發(fā)生聚集或者形成蛋白質(zhì)片斷[32]。氧化后的MP很可能產(chǎn)生一些高分子化合物，聚集在一起，在分離膠頂部聚積，甚至存在于濃縮膠中，無法進(jìn)入分離膠。由圖中可以看出，在凝膠頂部存在著一些顏色很深的條帶，很可能就是蛋白質(zhì)形成的聚集體，因其分子質(zhì)量超過200 kDa，不能透過凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而聚積在凝膠頂部。分子間二硫鍵和二聚酪氨酸的形成，以及蛋白質(zhì)自由基間的聚集等都可能引起高分子質(zhì)量聚集體的形成。由此推斷，氧化后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，可能是通過蛋白分子共價(jià)交聯(lián)或亞基片斷重組產(chǎn)生了高分子質(zhì)量聚集體。添加紅曲紅后各處理組的蛋白樣品其肌球蛋白重鏈(分子質(zhì)量為200 kDa)條帶和肌動(dòng)蛋白(分子質(zhì)量為43 kDa)條帶都明顯低于紅曲紅添加量為0%時(shí)的蛋白樣品，表明在較低亞硝酸鈉含量條件下添加紅曲紅能夠在不同程度上抑制MP的氧化變性。與未添加紅曲紅、亞硝酸鈉含量較高的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)蛋白的肌球蛋白重鏈(分子質(zhì)量為200 kDa)條帶和肌動(dòng)蛋白(分子質(zhì)量為43 kDa)條帶顏色與其接近，添加0.15%紅曲紅時(shí)蛋白的肌球蛋白重鏈(分子質(zhì)量為200 kDa)條帶和肌動(dòng)蛋白(分子質(zhì)量為43 kDa)條帶明顯減弱。表明用適量紅曲紅替代一部分亞硝酸鈉可以更有效抑制MP的氧化變性和降解，進(jìn)而可以提高肉制品品質(zhì)。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白(marker)；圖中1～6分別代表紅曲紅為0、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、CK，MHC-肌球蛋白重鏈；Actin-肌動(dòng)蛋白

2.2.5 紅外光譜分析

紅曲紅添加量對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如圖8所示。隨著紅曲紅添加量的不斷增加，MP二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量呈先增大后減小的趨勢(shì)，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量變化與之相反。β-螺旋是依靠MP分子內(nèi)氫鍵形成的，β-折疊是依靠蛋白質(zhì)分子間氫鍵形成的，蛋白質(zhì)分子間的展開程度和聚集程度可分別由α-螺旋含量和β-折疊含量表現(xiàn)出來。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)氧化程度增加時(shí)，蛋白分子中的氫鍵作用被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，MP凝膠的疏水相互作用發(fā)生變化，形成了更多的蛋白質(zhì)聚集體，使得MP二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致α-螺旋含量下降，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量上升。當(dāng)紅曲紅添加量為0.15%時(shí)α-螺旋含量達(dá)到最大值22.73%，表明紅曲紅本身就具有一定的抗氧化能力。之后隨著紅曲紅添加量的繼續(xù)增加，α-螺旋含量明顯減小(P<0.05)，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于紅曲紅添加量過高時(shí)，蛋白溶液后體系的電荷平衡發(fā)生改變，蛋白質(zhì)分子變性展開，改變了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)里的α-螺旋、β-折疊含量，α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊含量逐漸上升。添加紅曲紅后各處理組蛋白的α-螺旋含量均顯著大于紅曲紅添加量為0%時(shí)的α-螺旋含量(P<0.05)，β-轉(zhuǎn)角、β-折疊以及無規(guī)則卷曲含量明顯降低，表明在較低亞硝酸鈉含量條件下添加紅曲紅對(duì)維持蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定作用，能夠抑制MP氧化變性。與未添加紅曲紅、有較高亞硝酸鈉含量的對(duì)照組相比，低亞硝酸鈉含量下添加0.2%紅曲紅時(shí)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與其接近(P>0.05)，與對(duì)照組相比，添加0.15%紅曲紅時(shí)的α-螺旋含量明顯增多(P<0.05)，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量降低。表明適量添加紅曲紅可以更有效地抑制MP的氧化變性和降解。

圖8 紅曲紅添加量對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

3 結(jié)論

在腌制過程中，亞硝酸鈉對(duì)MP的功能性質(zhì)影響極為顯著，單純地降低亞硝酸鈉使用量會(huì)嚴(yán)重影響MP的功能性質(zhì)。

對(duì)豬肉MP羰基含量、巰基含量、表面疏水性和紅外光譜分析表明，紅曲紅能有效抑制MP分子結(jié)構(gòu)的變化，維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；對(duì)豬肉MP溶解度、乳化性和流變學(xué)性質(zhì)的分析表明，紅曲紅能有效改善MP的親水性質(zhì)、表面性質(zhì)和凝膠性質(zhì)。

從MP功能特性的角度考慮，低亞硝酸鈉含量(0.005%)條件下，紅曲紅的最適添加量為0.15%，此時(shí)豬肉MP的功能性質(zhì)優(yōu)于高亞硝酸鈉含量(0.01%)實(shí)驗(yàn)組，紅曲紅添加量濃度過高或過低都會(huì)影響低硝肉制品的加工性能。