秸稈堿預處理液脫毒及其在丁醇發酵中的應用

董晉軍，馬寶劍，龔磊，韓瑞枝，許國超，周婕妤，倪曄*

1(江南大學 生物工程學院，生物催化與酶工程研究室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

預處理是秸稈類生物質原料用于發酵工業的首要環節，目前主流的預處理方法有蒸汽爆破、稀酸法和稀堿法等[1-4]。其中效果較好的方法是稀堿法[5-6]，該方法很有希望用于工業生產[7]。而稀堿法預處理可破壞木質素和半纖維素間的化學鍵，相對于酸法預處理具有較強的脫木質素能力，且預處理過程中糖損失較少。木質纖維素預處理液中不僅含有抑制菌體生長的酚類、酸類、酮類和呋喃類等毒素[8-9]，而且對環境造成嚴重的污染。相對于堿法預處理，酸法預處理液由于木質素含量較低，所以顏色較淺，目前對酸法預處理液進行脫毒的研究較多[10-11]，但對堿預處理液脫毒工藝鮮見報道。

本研究以玉米秸稈為原料，采用稀堿預處理法，先加酸沉淀以去除堿溶性木質素，再以活性炭脫毒的方式將殘留的毒素進一步去除，并將脫毒后的預處理液用于水解過程和丁醇發酵液，驗證其脫毒效果，以建立從源頭控制廢水的“清潔生產”工藝。該工藝在預處理后沒有廢水排放，僅有副產物堿溶性木質素，而木質素可以用來生產硫化鈉[12]、活性炭[13-14]、香蘭素[15-16]、無毒型生物抑制劑，還可以用于塑料和橡膠混料體系中[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈，山東澤生生物科技有限公司；纖維素酶(濾紙酶活150 FPU/mL，最適pH 4.8)，青島蔚藍生物股份有限公司；其他化學試劑均購自國藥集團。糖丁基梭菌(ClostridiumsaccharobutylicumDSM 13864)，德國DSMZ微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

DNP-9162恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；CP3900氣相色譜儀，美國瓦里安公司；LC1260高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；GI54T立式高壓滅菌鍋，南京庚辰科學儀器有限公司；Centrifuge 5810型臺式高速離心機，德國 Eppendorf 公司；FE28酸度計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HYL-C組合式搖床，江蘇強樂實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基配方

種子培養基[18](g/L)：牛肉膏10，酵母浸出粉10，可溶性淀粉1，葡萄糖5，NaCl 3，蛋白胨10，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，乙酸鈉3，調pH值至6.5，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基[18](g/L)：玉米秸稈水解液(還原糖50)，玉米漿干粉10 ，CaCO34，(NH4SO4) 2，K2HPO40.5，MnSO4·H2O 0.01，調pH值至6.5，120℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 玉米秸稈的堿預處理方法及木質素的提取方法

取粉碎后玉米秸稈100 g，配制1L、1%(質量分數) NaOH溶液，以固液比1∶10(g∶mL)的比例混合，然后于立式高壓滅菌鍋中以120℃加熱1 h，達到堿處理的效果。處理后過濾分離得預處理后秸稈和堿預處理液。預處理后秸稈用水沖洗至中性，置入烘干箱中60℃烘干，以備后續水解糖化實驗。

收集堿預處理液分別添加一定量的稀H2SO4調節pH后，12 000 r/min離心5 min去除堿溶性木質素，上清稀釋一定倍數后用分光光度計測OD420和OD280，以分析預處理液中抑制物的含量。

1.3.3 預處理液脫毒用于丁醇發酵

在15個100 mL三角瓶中分別加入6 g堿處理后的秸稈、48 mL堿預處理液，按梯度分別加入0、5、10、15、20 g/L的活性炭，每個梯度3個平行樣，于立式高壓滅菌鍋中120℃處理20 min進行脫毒。而后在超凈工作臺中取樣0.5 mL，12 000 r/min離心5 min，取上清液250 μL，稀釋到20倍和400倍測量OD420和OD280。

在無菌環境中加入干熱滅菌的CaCO31 g，將膜過濾除菌的纖維素酶(30 FPU/g秸稈)加入上述滅菌后的三角瓶中，水解36 h后在超凈工作臺按照10%的接種量接種C.saccharobutylicumDSM 13864。

1.4 分析方法

還原糖濃度的測定采用DNS法[19]，丁醇濃度的測定采用氣相色譜法[20]。

預處理液中毒素含量用比色法來測定，將預處理液稀釋20倍，OD420測定美拉德反應產物[21-22]，將預處理液稀釋400倍，OD280測定酚類化合物含量[23]。

2 結果與分析

2.1 工藝流程

玉米秸稈堿預處理液脫毒工藝流程如圖1所示。

圖1 玉米秸稈堿預處理液脫毒工藝流程圖

2.2 堿預處理液的脫毒

2.2.1 堿預處理液木質素的去除

OD420和OD280被用來評估預處理液中抑菌物質美拉德反應產物和酚類物質的含量。由圖2可知，隨著H2SO4添加量增加，預處理液pH逐漸下降，OD420和OD280也不斷下降；當H2SO4添加量達到9 g/L，pH為3.8左右時，OD280和OD420基本達到穩定；故選擇pH 3.8作為去除堿溶性木質素的最適pH。堿溶性木質素沉淀后預處理液顏色深度明顯降低，堿溶性木質素大量析出。

A-OD420；B-OD280

2.2.2 活性炭脫毒

加酸去除預處理液中堿溶性木質素的同時，也去除了一部分抑制菌體生長的毒素。為進一步去除預處理液中的毒素，采用了活性炭脫毒方法。比較了添加CaCO3緩沖pH值至5.0和不添加CaCO3條件下活性炭的脫毒情況(圖3)。當不添加CaCO3時，溶液pH值為3.8，較添加CaCO3低，而低pH有利于活性炭的吸附[24]。因此，不添加CaCO3時活性炭的脫毒效果較好，尤其是苯酚類物質的脫毒效果較好(圖3-B)。當活性炭添加量為15 g/L時，脫毒效果基本達到穩定，OD420(稀釋20倍)為0.025，OD280(稀釋400倍)為0.003 4。

A-OD420；B-OD280

2.3 堿預處理后玉米秸稈的水解糖化

當堿預處理液活性炭脫毒后，測定預處理液中含有少量還原糖(小于0.5 g/L)，因為在堿性條件下預處理水解的部分還原糖發生羥醛縮合反應生成羧酸，如乳酸和乙酸[25]。利用CaCO3作為pH緩沖劑加入預處理液與預處理好的秸稈混合并添加纖維素酶水解(圖4)。當活性炭添加量不斷提高，水解的還原糖略有提高。當活性炭質量濃度為20 g/L，水解36 h后還原糖質量濃度達到63.5 g/L。以檸檬酸鈉緩沖液、不加活性炭為對照，36 h水解還原糖質量濃度為57.4 g/L。pH緩沖劑CaCO3和檸檬酸鈉(對照，結果未顯示)對水解的影響不大。由于秸稈水解過程固液比較大，過量CaCO3可控制pH值在5.0左右，所以選擇CaCO3代替檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)作為pH緩沖劑。乳酸發酵過程中也常用CaCO3作為pH緩沖劑[26]。

對照1-不添加活性炭；對照2-活性炭添加量10g/L

2.4 堿預處理秸稈及預處理液脫毒用于丁醇發酵

將酶水解后的秸稈水解液(連同活性炭和未徹底水解的秸稈殘渣)在無菌環境中接入丁醇發酵菌種C.saccharobutylicumDSM 13864種子液和滅菌的培養基濃縮液進行發酵(圖5)。發酵72 h后測定發酵液中丁醇含量，不添加活性炭的水解液沒有丁醇產生；隨著活性炭濃度的加大，丁醇濃度逐漸升高；當活性炭質量濃度為15 g/L時，丁醇濃度趨于穩定，達到10.2 g/L，相對于葡萄糖對照組,丁醇產量提高了21%。

圖5 堿預處理秸稈及脫毒后的預處理液用于丁醇發酵

3 結論

本研究基于源頭控制的理念，將堿預處理液進行脫毒并用于秸稈水解和丁醇發酵過程，以減少廢水排放。首先，在堿預處理液中加入9 g/L的H2SO4，pH 3.8 時，可沉淀預處理液中的堿溶性木質素。接著，對去除堿溶性木質素的堿預處理液進行活性炭脫毒，不同加量活性炭對秸稈的水解影響不明顯，但對丁醇發酵影響較大。當活性炭添加量為15 g/L時，發酵72 h丁醇質量濃度達到最高10.2 g/L，而不添加活性炭脫毒的預處理液在發酵中不產丁醇。本研究工藝對利用秸稈進行無廢制造生物燃料有一定的參考價值。