新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸能力評(píng)價(jià)

楊行，王莉，郭麗君，張明，周玉貴，王玉濤*

1(喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什， 844000)2(新疆玉昆侖天然食品工程有限公司，新疆 喀什, 844000)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類(lèi)可將碳水化合物發(fā)酵成乳酸、革蘭氏陽(yáng)性、原核生物、兼性厭氧型或厭氧型的細(xì)菌。常見(jiàn)的乳酸菌分屬為乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬等，其中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬與人類(lèi)健康關(guān)系密切[1-3]，在人體內(nèi)可以發(fā)揮多種生理生化功能，如調(diào)控胃腸道中正常菌群的數(shù)量，維持腸道中的微生態(tài)平衡，抑制腸道中有害菌的生長(zhǎng)，達(dá)到改善胃腸道功能的目的，提高人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率以及機(jī)體免疫力等[4-6]。乳酸菌在乳制品發(fā)酵過(guò)程中的主要作用是產(chǎn)酸(乳酸、乙酸、丙酸、檸檬酸和琥珀酸等)和產(chǎn)香(丁二酮、乙醛等)，而產(chǎn)酸能力是乳酸菌的一個(gè)重要特性，用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑要求產(chǎn)酸能力強(qiáng)，可以縮短發(fā)酵時(shí)間，節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率[7-8]。因此篩選和保存高產(chǎn)酸能力的乳酸菌，將其利用于生產(chǎn)發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)其更高的利用價(jià)值[9-10]。

喀什地區(qū)生態(tài)環(huán)境獨(dú)特，既有荒漠戈壁、綠洲濕地，又有干旱山地、高原冰川，這些獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境孕育了豐富多樣性的微生物資源；各民族聚居生活，傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣使得當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)酸奶制品情有獨(dú)鐘，常見(jiàn)有黃牛酸奶、牦牛酸奶、馬奶酒、奶疙瘩、干酪等乳制品[11-12]，其中保留了豐富的土著菌，因此挖掘該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的菌落結(jié)構(gòu)具有重要的意義。關(guān)于該地區(qū)乳酸菌的研究，僅楊潔等[13]從采集的22份酸奶樣品，利用傳統(tǒng)鑒定方法并結(jié)合16S rDNA 序列分析鑒定出56株乳酸菌，其中德氏乳桿菌46株、發(fā)酵乳桿菌2株、瑞士乳桿菌2株、嗜酸乳桿菌1株、雞乳桿菌2株、屎腸球菌1株、耐久腸球菌2株，對(duì)喀什地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的菌相結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，但對(duì)這些乳酸菌的產(chǎn)酸能力未見(jiàn)報(bào)道。本研究從喀什地區(qū)10個(gè)縣市采集了29份農(nóng)牧民自制的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，利用平板劃線分離法篩選出單一菌株，進(jìn)而用16S rDNA進(jìn)行菌種的分子鑒定，通過(guò)測(cè)定pH值和總酸度對(duì)菌株的產(chǎn)酸能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)的優(yōu)良菌株，為開(kāi)發(fā)和制作優(yōu)質(zhì)酸奶制品提供優(yōu)良菌株，對(duì)豐富和挖掘傳統(tǒng)菌劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自喀什地區(qū)10個(gè)縣市農(nóng)牧民自制的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，奶源均為黃牛奶。其中喀什市樣品5份、疏附縣2份、疏勒縣2份、英吉沙縣2份、岳普湖縣2份、阿克陶縣2份、莎車(chē)縣4份、麥蓋提縣3份、澤普縣3份、葉城縣4份，共計(jì)29份樣品(乳酸菌編號(hào)以地區(qū)首字母+樣品份數(shù)+菌落數(shù)記)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；引物，購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自?shī)W博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5%過(guò)氧化氫、盧戈氏碘液、結(jié)晶紫、番紅、95%乙醇、酚酞、0.1mol/L NaOH等，均購(gòu)自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP6002 金諾電子天平；立式壓力蒸汽滅菌鍋，LD2X-50KBSS 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱，永光明；BCD-205HK電冰箱，容聲；PHS-3C pH計(jì)，雷磁；SHA-C水浴恒溫振蕩箱，金怡；H-2050R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)；Bio-Rad型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化[14]

取3 mL酸奶樣品接種于30 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟，使其恢復(fù)活性。采用平板法，將充分活化后的樣品進(jìn)行稀釋涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48～72 h。挑取有透明環(huán)的大小、形狀、顏色不同的單個(gè)菌落，劃線于平板培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)一步純化菌株。仔細(xì)觀察培養(yǎng)基上的菌落是否為單一、相同的菌落，如有不同菌落，則繼續(xù)劃線純化。待平板上生長(zhǎng)的全部為單一菌落時(shí)，記錄菌落大小、形態(tài)、顏色、分散情況等。

1.3.2 乳酸菌的初步鑒定及保存

按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]中的乳酸菌的生化鑒定試驗(yàn)方法，將過(guò)氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)鏡檢呈桿狀的菌株暫定為乳桿菌，鏡檢呈球狀、單個(gè)、成對(duì)或鏈狀的暫定為乳球菌。將分離純化后的，革蘭氏染色陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性的菌株確定為疑似乳酸菌，并轉(zhuǎn)接到MRS固體斜面試管中標(biāo)號(hào)后，在4℃下保藏備用。

1.3.3 單菌株產(chǎn)酸能力的評(píng)價(jià)[14]

鉀是農(nóng)作物三大營(yíng)養(yǎng)元素肥料之一，對(duì)保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全具有舉足輕重的作用。我國(guó)是一個(gè)缺鉀國(guó)家，資源儲(chǔ)量?jī)H占世界約2%。我國(guó)探明的資源儲(chǔ)量以鹽湖鉀礦為主，分布在青海柴達(dá)木盆地和新疆羅布泊地區(qū)。隨著兩大鉀肥基地建成，特別近十年來(lái)，我國(guó)先后突破了低品位固體鉀鹽、尾礦利用、深部鹵水開(kāi)采等技術(shù)，使得鉀鹽可采量成倍增加。

將充分活化的菌液，按3%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，39 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后檢測(cè)酸度和pH值，每株菌做3組檢測(cè)，結(jié)果取平均值。

pH值的檢測(cè)：采用pH計(jì)直接測(cè)定讀數(shù)。開(kāi)啟酸度計(jì)預(yù)熱30 min后，用pH 6.86和pH 4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校準(zhǔn)。

酸度的檢測(cè)：按照GB 5413.34—2010中的方法測(cè)定[17]。

1.3.4 乳酸菌DNA提取

乳酸菌DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求操作，試劑盒中已有溶菌酶，用于乳酸菌破壁，并延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

1.3.5 16S rDNA PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)[18]

乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物選用細(xì)菌通用擴(kuò)增引物：正向：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，反向：1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；30個(gè)循環(huán)，在4 ℃下保存。

表1 16S rDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL)

PCR擴(kuò)增結(jié)束后吸取3 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL的10×DNA loading buffer充分混合，點(diǎn)樣于1.0%的瓊脂糖凝膠孔中進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察其擴(kuò)增產(chǎn)物情況，若菌株P(guān)CR擴(kuò)增成功，則約在1 500 bp附近可以見(jiàn)清晰單一條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.6 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件雙向拼接后，登陸NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，將拼接結(jié)果采用BLAST軟件與已知序列進(jìn)行相似性分析[19]，利用Mega7軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及菌落特征

本實(shí)驗(yàn)共分離到59株乳酸菌，所有菌株經(jīng)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陰性，經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下鏡檢觀察呈現(xiàn)紫色/藍(lán)紫色，菌落多為球狀、粗桿狀、短桿狀。從菌落形態(tài)觀察結(jié)果(圖1)來(lái)看，桿狀菌菌落生長(zhǎng)密集、多為圓形乳白色、邊緣略透明、表面凸起，生長(zhǎng)較為分散、少數(shù)有成片出現(xiàn)；球狀菌菌落生長(zhǎng)密集、多為白色、淺灰色，成片或鏈狀生長(zhǎng)。

a-MRS培養(yǎng)基乳酸菌涂布分離;b-MC培養(yǎng)基乳酸菌涂布分離;c-乳酸菌油鏡鏡檢

2.2 單菌株產(chǎn)酸能力結(jié)果

2.2.1 pH值測(cè)定結(jié)果

MRS液體培養(yǎng)基的pH值為5.98，單菌株在MRS液體培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，結(jié)果顯示(表2),pH值最大為5.79， pH值最小為3.85；pH≤5.05的菌株有40株，約占總菌株數(shù)的67.8%，其中pH在4.26～4.45的菌株較多，有18株；其次是在4.46～4.65和5.46～5.65，各有10株。

表2 菌株pH值數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2.2 總酸度測(cè)定結(jié)果

MRS液體培養(yǎng)基的總酸度值為50°T，單菌株在MRS液體培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，結(jié)果顯示(表3)，酸度值最大為183°T，酸度值最小為41°T，酸度值≥100°T的菌株有36株，約占總菌株數(shù)的61.02%，其中酸度在121～130°T之間的較多，有14株；其次是51～60°T之間，有10株。

表3 菌株總酸度值數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2.3 不同地區(qū)乳酸菌pH值和總酸度結(jié)果分析

從11個(gè)縣市中分離到得到的59株菌，pH≤5.05的數(shù)量為40株。其中阿克陶縣樣品最多，有7株，約占17.5%；其次是莎車(chē)縣樣品中有6株，約占15%；SL·1-1、SL·2-2-1兩株菌pH值最低，為3.85，其次是SL·1-2和SC·3-1兩株菌，pH值為3.88?？偹岫取?00°T的數(shù)量為36株，阿克陶縣樣品中的最多，有6株，約占16.67%；其次是葉城縣和莎車(chē)縣，有5株，約占13.89%；SL·1-1的酸度最高，達(dá)到183°T，其次是SC·3-1和SC·2-3-4兩株菌，酸度值163°T。不同地區(qū)乳酸菌pH值和總酸度結(jié)果分析如表4所示。

表4 不同地區(qū)乳酸菌pH值和總酸度結(jié)果

注：表中括號(hào)內(nèi)為占總數(shù)的百分比。

2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)結(jié)果

59株菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察，圖2為其中13株菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果。從圖中可以看出所有菌株均有擴(kuò)增產(chǎn)物，在1 500 bp附近均有清晰且單一的目的條帶。

M-DL2000 markers;1-YC·3-1;2-SC·3-1;3-KS·3-1;4-SC·2-2;5-SF·1-2;6-YJS·1-3-1;7-MGT·3-1;8-YJS·1-1;9-MGT·3-5;10-YC·4-2;11-KS·1-2;12-MGT·1-3;13-YJS·1-11

2.4 16S rDNA 序列分析結(jié)果

59株樣品送樣測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯、比對(duì)分析，獲得52條有效序列。將52株樣品的測(cè)序結(jié)果在GeneBank中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，得出KS·3-1等10株菌為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)，占測(cè)序總數(shù)的19.23%；AKT·3-4等8株菌為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，占測(cè)序總數(shù)的15.38%；YC·1-5-2等4株菌為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，占測(cè)序總數(shù)的7.69%；MGT·3-1等23株菌為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)，占測(cè)序總數(shù)的44.23%；ZP·3-2等7株菌為耐久腸球菌(Enterococcusdurans)，占測(cè)序總數(shù)的13.46%。部分菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

圖3 部分乳酸菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 菌種種類(lèi)與產(chǎn)酸能力分析

pH值和總酸度值是乳酸菌產(chǎn)酸能力的重要衡量指標(biāo)，pH值和總酸度指標(biāo)經(jīng)Origin分析，分析結(jié)果顯示(圖4,圖5)，大部分菌株的pH值主要集中在4.0～5.0，部分的屎腸球菌、耐久腸球菌的pH值較高；總酸度值大于130°T的主要德氏乳桿菌、乳酸片球菌，發(fā)酵乳桿菌主要集中在130～110°T，屎腸球菌主要集中在140～90°T，也有部分菌株總酸度較低。可以得出喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的主要是德氏乳桿菌、乳酸片球菌和發(fā)酵乳桿菌。

1-德氏乳桿菌;2-發(fā)酵乳桿菌;3-耐久腸球菌;4-屎腸球菌;5-乳酸片球菌(圖5同)

圖5 乳酸菌菌種種類(lèi)與總酸度值關(guān)系圖

3 討論

WANG等認(rèn)為菌株間的16S rDNA相似度大于97%，可能屬于同一個(gè)種；相似度在99%以上，可能屬于同一亞種[20]。但是建立在形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法，對(duì)樣品中乳酸菌的鑒定也較為重要，所以將生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)方法結(jié)合起來(lái)，可以更快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)微生物鑒定。

本研究通過(guò)傳統(tǒng)分離方法對(duì)喀什地區(qū)農(nóng)牧民自制的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶乳酸菌進(jìn)行分離篩選，對(duì)單株進(jìn)行pH值和總酸度值的測(cè)定，菌株SL·1-1(Lactobacillusfermentum)在培養(yǎng)24 h后pH值最低為3.85，總酸度值最高為183°T，這與劉振民等[21]研究的乳酸菌產(chǎn)酸特性基本一致。林龍鎮(zhèn)等[9]研究中發(fā)酵乳桿菌菌液的最終pH值在4.3左右，本實(shí)驗(yàn)中的發(fā)酵乳桿菌YPH·1-3-3最終pH值為4.1。蔣艾廷等[22]從塔城的傳統(tǒng)酸奶中分離了30株產(chǎn)酸快的乳酸菌，經(jīng)鑒定主要為乳桿菌屬、腸球菌屬和片球菌屬，在本研究中都有分離得到，但其產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的為植物乳桿菌?？傮w來(lái)看pH值在4.26～4.45的菌株較多，總酸度值在121～130°T的菌株較多，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌及乳酸片球菌等不同乳酸菌的產(chǎn)酸能力也存在較大差異。

通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增序列比對(duì)鑒定，得到德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)10株、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)8株、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)4株、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)23株、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)7株。與袁雪林等[23]、楊潔等[13]研究的喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中的乳酸菌多樣性基本一致，但他們都得出德氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)菌群，并且沒(méi)有分離出瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雞乳桿菌。屎腸球菌屬腸球菌屬，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群的一部分，尚天翠等[24]從新疆伊犁的傳統(tǒng)乳制品中也分離出了屎腸球菌。AZAT等[25]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵干酪中分離得到6株乳酸菌，其中鼠李糖乳桿菌R4有較高的實(shí)用潛力，本實(shí)驗(yàn)中未有分離得到?？梢?jiàn)，不同地區(qū)、不同時(shí)間、不同采樣地點(diǎn)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中乳酸菌的種類(lèi)存在較大差異，這可能與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、氣候、奶源、制作方法、發(fā)酵劑、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

從喀什地區(qū)農(nóng)牧民自制的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離篩選的乳酸菌，通過(guò)分子鑒定出屎腸球菌23株，發(fā)酵乳桿菌8株，耐久腸球菌7株，德氏乳桿菌10株，乳酸片球菌4株，其中屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)菌群。

通過(guò)pH值及總酸度值的檢測(cè)，pH≤5.05的菌株有40株，約占分離數(shù)的67.8%，主要集中在4.26～4.45；總酸度值≥100°T的菌株有36株，約占分離數(shù)的61.02%，主要集中在110～130°T；產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的主要是德氏乳桿菌、乳酸片球菌和發(fā)酵乳桿菌，其中菌株SL·1-1在培養(yǎng)24 h后pH值最低為3.85，總酸度值最高為183° T，可以作為優(yōu)良菌株保存使用。