基于聚類分析的濃縮蘋果汁風味品質分析與評價

柴鵬飛，李林潔，2，劉靜，趙方圓，宋佳，鄭宇，石磊，萬守朋，王敏*

1(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津科技大學 生物工程學院，天津， 300457)2(國家知識產權局專利局專利審查協作天津中心，天津， 300304)3(天津市利民調料有限公司，天津， 300308)

蘋果是世界上種植量最大的水果之一，富含多種氨基酸、糖類、有機酸等營養成分，以及維生素、礦物質等微量元素[1]。濃縮蘋果汁是以蘋果為原料，經物理方法去除一定比例的水分獲得的純天然產品[2]。2016年，我國鮮蘋果和濃縮蘋果汁出口量分別為132.20萬t和50.64萬t，均居世界首位[3]。濃縮蘋果汁主要用于飲料等食品的生產，雖然所有產品都符合《濃縮蘋果汁》(GB/T 18963—2012)等相關國家標準[4]，但由于原料成熟度、生產管理等方面的原因，濃縮蘋果汁批次間會存在風味差異，有可能會對其后續加工產品的風味品質產生影響。蘋果汁的品質通常是依據《感官分析食品感官質量控制導則》(GB/T 29605—2013)及《感官分析方法學總論》(GB/T 10220—2012)等[5-6]相關標準來確定和檢驗蘋果汁感官質量的，但感官評價存在著主觀性強、差異性大、缺乏數據支撐等缺點[7]。

風味是評價食品品質特征的重要指標，通常人們所講的風味主要是指味感和嗅感的綜合[8-9]。其中，對味感產生影響的主要是食品中有機酸、氨基酸、糖類等不揮發性物質，對嗅感產生影響的主要是酯類、醇類、酮類等各種揮發性風味物質。目前已經鑒定出的蘋果汁香氣成分已有300多種[10]，主要包括酯類、醇類、醛類[11-13]，另含有少量酮類、烴類、酚類等物質。另外，有機酸、糖類等不揮發性物質也因其直接影響果汁的酸度、甜度等有著同樣重要的地位。由于蘋果汁中風味物質種類眾多、組成復雜，且各類物質的來源并不能完全解析，給準確快速地判別濃縮蘋果汁風味品質帶來了諸多不便。

聚類分析(cluster analysis, CA)是一種用于分析多變量的技術[14]。其根據研究對象的多樣性，將其分為相對同質的群組，并依據樣品品質特性的相似程度將其聚合在一起，相似度大的優先聚合，最終按照類別的綜合性質將多個品種聚合，進而完成聚類分析的過程[15]。此方法在農產品品種譜系、食品主成分及食品品質分析領域應用廣泛。本論文采用風味化學分析方法，對同一年份和地區的濃縮蘋果汁樣品進行分析，篩選對濃縮蘋果汁風味品質影響較大的風味物質建立其聚類分析方法，為濃縮蘋果汁風味品質快速鑒定提供依據，也為生產企業優化工藝參數提供理論支撐和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁樣品(2017和2018年榨季)，陜西某濃縮蘋果汁生產企業；糖類、氨基酸、有機酸標準品(色譜級)，上海源葉生物科技有限公司；2-辛醇、H2SO4、醋酸鈉、NaCl、DNFB、NaHCO3、KH2PO4、DNS試劑為分析純，天津北方天醫化學試劑廠；乙腈、乙酸為色譜純，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

CP1502電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；TDL-SC低速大容量臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；S20K pH計，梅特勒·托利多儀器有限公司；LH-T20手持折光儀，杭州陸恒生物技術有限公司；Agilent1100型HPLC儀，安捷倫科技有限公司；GC-789011型GC-MS，安捷倫科技有限公司。

1.3 樣品的選取與分析

1.3.1 樣品的選取

由廠家提供2017年生產的符合《濃縮蘋果汁》等相關標準的12個批次濃縮蘋果汁樣品，由10名經過品評培訓的專業人員組成評定小組對濃縮蘋果汁樣品的香氣、滋味2個因素進行感官評定。采取10分制打分，對2個因素的得分分別按50%的權重計算出感官評定綜合得分，感官評價評分表見表1。其中，感官評定綜合得分大于等于8分的，認定為風味較好批次(A類)樣品，得分小于8分的，認定為風味相對較差的(B類)樣品。樣品17-1～17-12感官評價綜合得分分別為9.05±0.325、8.95±0.345、8.725±0.3、8.5±0.425、8.45±0.3、8.025±0.37、6.075±0.38、6.275±0.3、6.125±0.365、6.65±0.39、6.5±0.405、5.025±0.38，樣品17-1～17-6得分大于8分，認定為A類樣品，樣品17-7～17-12得分低于8分，認定為B類樣品。兩類樣品感官評價得分經顯著性檢驗P<0.05，兩組樣品感官評價綜合得分具有顯著性差異。

表1 感官評價評分表

由廠家提供2018年生產的濃縮蘋果汁樣品(18-1～18-8)，用于該方法的驗證。

1.3.2 樣品的分析

(1)揮發性風味物質分析

取2 mL樣品置于30 mL氣相玻璃瓶，加入4 mL超純水，2 g NaCl和1 μL 1.6 mg/mL 2-辛醇(內標)，加入磁力攪拌器，密封，40 ℃水浴平衡10 min，然后插入固相微萃取頭，40 ℃水浴40 min，磁力攪拌速度為450 r/min。隨后迅速將萃取頭插入進樣口解吸5 min，用GC-MS檢測分析香氣成分。

GC-MS條件：Agilent HP-5毛細管柱(30 m×250 mm×0.25 μm)。進樣口溫度250 ℃，氦載氣流速1.0 mL/min，不分流。柱溫程序：35 ℃保持1 min，以1 ℃/min升溫至70 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至230 ℃維持2 min。質譜檢測溫度為220 ℃，EI電離能量為70 eV，捕獲方式為全掃描，掃描范圍為30～600m/z。

(2)氨基酸含量分析

取樣品1 mL，12 000 r/min離心20 min，取上清液過膜。準確量取過膜后的樣品10 μL于1 mL離心管中，加入已經配制好的衍生緩沖溶液200 μL，混勻后再加入衍生試劑溶液100 μL，混勻，將容量瓶置于60 ℃水浴中暗處恒溫加熱60 min，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液700 μL稀釋至刻度并搖勻，放置15 min后用0.22 μm濾膜過濾即可以開始進行HPLC檢測分析氨基酸。

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：33 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；流動相A為50%乙腈，流動相B為0.4%醋酸鈉，稱取4.1 g醋酸鈉，加400 mL水，用HAC調pH至6.4，定容到1 L。

(3)有機酸和糖類化合物分析

將各濃縮蘋果汁樣品分別稀釋10倍，然后各取2 mL稀釋液，置于離心機，以12 000 r/min轉速離心5 min后取上清液，濾液經0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測有機酸、糖類物質。

有機酸檢測條件，色譜柱：Aminex HPX-87H lon Exclusion Column (7.8 mm×300 mm)；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；紫外檢測器波長：215 nm；流動相：5 mmol/mLH2OS4；運行時間為21 min。

糖類化合物檢測條件，色譜柱：Prevail Carbohydrate ES (250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：40 ℃；流速：1.2 mL/min；檢測器溫度：45 ℃；流動相為V(乙腈)∶V(水)=78 ∶22。

1.4 主要差異風味化合物的篩選

首先分別對各樣品揮發性風味物質、氨基酸、有機酸、糖類等風味物質進行主成分分析，確定該類化合物是否適用于樣品的區分。若兩類樣品在該類風味物質組成上確實存在差異，再對該類風味物質中的所有化合物進行綜合打分，打分結果大于0的物質即為該類風味物質中的主要差異風味化合物。

1.5 樣品聚類分析與驗證

對篩選得到的各類主要差異風味化合物進行組合，首先對各化合物濃度進行標準化處理以消除不同綱量帶來的影響，并進一步進行聚類分析，篩選出的能夠顯著區分A、B兩類樣品的主要差異風味物質組合，即在該組合條件下A、B兩類樣品具有最低的類間相似性，且同類樣品具有最高的類內相似性。

利用獲得的最優組合，對待測濃縮蘋果汁樣品進行聚類分析，驗證該方法的重復性。

1.6 數據處理方法

采用Excel和OrginPro 9.0軟件對數據進行分析處理。采用SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。采用IBM SPSS Statistics 軟件進行因子分析、綜合打分，得到造成此差異的所有物質貢獻率高低的排名，從而篩選得到對感官評價結果影響較大的風物物質。

采用Minitab 16.0軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 濃縮蘋果汁理化指標分析

依據GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[16]及GB/T 18963—2012《濃縮蘋果汁》[4]中規定的相關濃縮蘋果清汁理化指標檢測方法對12個濃縮蘋果汁樣品進行可溶性固形物、總酸、pH、還原糖的測定。各批次濃縮蘋果汁理化指標測定結果如表2所示，這12個濃縮蘋果汁樣品標均符合國標相關要求，可溶性固形物(20 ℃，以折光計)≥65.0 Bx，可滴定酸(以蘋果酸計，可溶性固形物11.5%條件下測定)≥0.70。根據感官評價結果將12個樣品分為兩類，對品質較好的A類樣品(17-1～17-6)和品質較差的B類樣品(17-7～17-12)的理化指標進行差異顯著性分析發現，A類樣品和B類樣品在可溶性固形物、總酸、pH和還原糖指標上并不存在顯著差異(P值分別為0.628、0.248、0.127、0.751，P>0.05)，由此可知，樣品的品質好壞與理化指標無關，主要是由風味物質組成及濃度差異導致。因此進一步對其主要風味化合物進行分析檢測。

表2 濃縮蘋果汁理化指標測定結果

2.2 濃縮蘋果汁主要風味物質分析

2.2.1 揮發性風味物質分析檢測

濃縮蘋果汁樣品中揮發性物質種類和含量情況結果如圖1所示，12個樣品共檢測到39種揮發性風味物質，但樣品間揮發性物質組成存在差異，其中樣品17-1揮發性風味物質總相對含量最高，揮發性風味物質種類數也最多，樣品17-11次之。

圖1 濃縮蘋果汁中揮發性風味物質種類和相對含量

在對濃縮蘋果汁樣品中揮發性風味物質初步分析的基礎上，采用統計學軟件(SIMCA-P 11.5)進行主成分分析，進一步分析兩類樣品揮發性風味物質的異同，結果如圖2所示，其中主成分1、主成分2分別解釋了總體信息的62.25%和16.71%，表明主成分分析結果比較可靠，能較好地解釋樣品的總體信息。

圖2 濃縮蘋果汁中揮發性物質主成分分析

由表3可以看出，所有的揮發性風味物質中綜合打分排名靠前的化合物主要有糠醛、2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸異丁基壬酯、1,2-苯二甲酸-2-甲基丙基酯、(E)-1-(2，6，6-三甲基-1，3-二環己烷-1-乙基)-2-丁烯-1-酮及鄰苯二甲酸二丁酯(其中已查明糠醛具有特殊的杏仁香味，(E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-二環己烷-1-乙基)-2-丁烯-1-酮具有奶油香氣)，說明這些化合物可能對濃縮蘋果汁感官評定結果有重要影響。但是，由圖2可以看出，樣品17-1、17-3及17-11分散為3個孤點，說明利用揮發性風味物質難以很好地區分AB兩類樣品，主要由于同類樣品間的揮發性風味物質存在較大差異，這與圖1所得到的分類及含量結果保持一致，因此在后續主要差異風味化合物的篩選過程中不考慮揮發性風味物質。

表3 濃縮蘋果汁揮發性物質主成分綜合得分

2.2.2 氨基酸

采用柱前衍生法及紫外檢測器-高效液相色譜儀對濃縮蘋果汁樣品中的氨基酸成分進行測定，結果如圖3所示，在氨基酸組成上，兩類濃縮蘋果汁中氨基酸種類組成情況基本相似，但濃度各不相同，對A、B兩類樣品氨基酸總濃度進行T檢驗，得出t值的絕對值為2.765，表明兩組數據存在差異性顯著(P<0.05)。有趣的是，A類濃縮蘋果汁中氨基酸總濃度平均水平(11.8 g/L)低于B類(13.7 g/L)。氨基酸是食品中常見的風味物質，對食品的香氣和滋味具有重要影響。不同的氨基酸呈現不同的風味，從而對食品的整體風味產生影響。如圖3所示，濃縮蘋果汁樣品中含量較高的氨基酸依次是蛋氨酸(31.9%～47.8%)、絲氨酸(25.4%～39.5%)和天冬氨酸(10.3%～16.4%)，這些氨基酸對濃縮蘋果汁的風味有較大影響。其中，蛋氨酸具有腥臭氣味，絲氨酸呈甜味，天冬氨酸呈鮮味，這些氨基酸可能對蘋果特有的香氣和滋味產生負面作用，因此氨基酸濃度較低的樣品反而感官品評的得分較高。

圖3 濃縮蘋果汁氨基酸分類含量

為了更為直觀地得到12個批次濃縮蘋果汁樣品氨基酸組成的差異性情況，進行主成分分析，結果如圖4所示。其中主成分1、2分別解釋了總體信息的47.51%和28.62%，表明主成分分析結果比較可靠。由圖4可知，兩類樣品被很好地分到2個區域，這說明可以通過氨基酸組成的差異來區分兩類濃縮蘋果汁樣品品質。

圖4 濃縮蘋果汁中氨基酸主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對氨基酸測定結果進行因子分析及綜合打分處理，結果見表4，在14種氨基酸成分中有3種物質得分大于0，即它們的貢獻率大于平均水平，分別為蛋氨酸、絲氨酸和天冬氨酸，因此暫定這3種氨基酸為差異風味化合物，用于后續聚類分析。

表4 濃縮蘋果汁氨基酸主成分綜合得分

2.2.3 有機酸

利用紫外檢測器-高效液相色譜儀對濃縮蘋果汁樣品中的有機酸成分進行測定[18]，共檢測到6種有機酸，其中乳酸含量及未檢測到的富馬酸均符合國標要求。各濃縮蘋果汁樣品中有機酸具體組成情況如圖5所示，含量較高的有機酸依次是蘋果酸(62.7%～72.3%)、乳酸(19.8%～30.9%)、檸檬酸(4.6%～7.5%)。同時，前6個感官評定較好批次濃縮蘋果汁除蘋果酸、乳酸平均含量稍低于較差批次果汁外，其余4類有機酸平均含量均高于較差批次。

圖5 濃縮蘋果汁中有機酸分類含量

在有機酸含量測定結果基礎上，進行主成分分析，其結果如圖6所示。其中主成分1、主成分2分別解釋了12個濃縮蘋果汁樣品中6種有機酸含量總體信息的58.99%和25.11%，表明主成分分析結果比較可靠，能較好解釋樣品的總體信息。可觀察到除去1、9兩點，其余樣品濃縮蘋果汁被較好的分到2個區域，可見濃縮蘋果汁樣品因其有機酸組成上的差異。

圖6 濃縮蘋果汁中有機酸主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對除去17-1及17-9樣品其余10個批次濃縮蘋果汁的有機酸含量測定結果進行因子分析及綜合打分處理。由表5綜合得分結果可知，在6種有機酸成分中有2種物質得分大于0值，即它們的貢獻率大于平均水平，進而得出這6種有機酸成分中對蘋果汁品質影響較大的2種物質，分別為蘋果酸和乳酸，選取這2個物質用于后續聚類分析。

表5 濃縮蘋果汁有機酸主成分綜合得分

2.2.4 糖類物質

利用示差折光檢測器-高效液相色譜儀對濃縮蘋果汁樣品中的糖類物質成分進行測定，共檢測到4種糖類物質，如圖7所示，含量較高的糖類物質為果糖(52.3%～56.6%)，其次是葡萄糖(21.1%～28.5%)。

圖7 濃縮蘋果汁糖類物質分類含量

在糖類物質含量測定結果基礎上，進行主成分分析，其結果如圖8所示。其中主成分1、主成分2分別解釋了12個濃縮蘋果汁樣品中4種糖類含量總體信息的43.18%和32.07%，表明主成分分析結果比較可靠，能較好地解釋樣品的總體信息。可觀察到12個樣品點分布相對較分散，說明各樣品的糖類物質組成存在較大波動性，但2個區域區分較明顯，由此說明果汁樣品在糖類物質組成上存在的差異性可使其較好地分為兩類。

圖8 濃縮蘋果汁中糖類物質主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對糖類物質測定結果進行因子分析及綜合打分處理，由表6可知，在4種糖成分中有2種物質得分大于0值，分別為果糖和葡萄糖，選取這2個物質用于后續聚類分析。

表6 濃縮蘋果汁糖類物質主成分綜合得分

2.3 主要風味物質的聚類分析

2.3.1 聚類分析模型優化

由濃縮蘋果汁的風味物質測定及主成分分析結果可知，揮發性物質的PCA得到的2個樣品聚集區域區分不是十分明顯，而根據氨基酸、有機酸和糖類的均可以將濃縮蘋果汁分到2個區域，因此選取這3類不揮發性物質(共7種)進一步做聚類分析，優化聚類分析模型。

由于各個指標的單位不同、量綱不同、數量級不同，不便于分析，甚至會影響評價的結果。所以，首先對數據進行標準化處理，消除不同綱量帶來的影響，而后進行聚類分析。聚類分析結果如圖9，樣品17-1～17-6聚集為一類，類內樣品間相似性在53.12%～56.59%；17-7～17-12聚集為一類，其類內樣品間相似性在64.02%～68.06%。

由以上7種物質進行聚類分析得到的聚類結果并不理想，故將這7種物質進行排列組合再次聚類，力求得到最高的相似性值，為了保證結果的可靠性和全面性，組合物質個數至少選擇5個，共得到29種物質組合方法，其聚類分析結果如表7。

圖9 濃縮蘋果汁的主要風味物質聚類分析

表7 不同風味物質組合聚類分析結果

注：“*”表示有一個樣品未正確聚類，“—”表示未能良好聚為兩類，故沒有相似性值。

通過分析可得到第24號組合即天冬氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、果糖、葡萄糖進行聚類時得到聚類分析結果相對最好，其結果如圖10所示。將風味評定較好的批次濃縮蘋果汁分到一類，各果汁相似性聚集在54.95%～65.11%，風味較差批次濃縮蘋果汁分到一類，各果汁相似性聚集在72.43%～84.26%。

圖10 濃縮蘋果汁的主要風味物質聚類分析

2.3.2 聚類分析方法的驗證

為了對以上所建立的蘋果醋原料風味品質判別方法進行驗證，隨機選取蘋果汁廠于2018年生產的8批次樣品，分別對以上樣品進行風味物質測定，然后進行聚類分析，其聚類結果如圖11所示，其中，觀測值1～5為濃縮蘋果汁樣品18-1～18-5，它們為感官評定為風味較好的批次，6～8為濃縮蘋果汁樣品18-6～18-8為風味較差批次。

圖11 濃縮蘋果汁的主要風味物質聚類分析

由圖11可看出用于驗證的8個濃縮蘋果汁樣品中樣品18-1～18-5類內相似性高于68.03%聚為一類，樣品18-6～18-8類內相似性高于78.65%聚為一類，說明風味較好與較差批次蘋果汁被明顯區分，由此也就驗證了利用所篩選的5個主要風味物質(蛋氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、果糖及葡萄糖)建立的聚類分析能用于濃縮蘋果汁樣品風味品質優劣的快速判斷。

3 結論

本文將人工感官評價手段與聚類判別方法相結合[21]，通過對感官評定較好和較差的2組濃縮蘋果汁的主要風味化合物進行分析檢測，利用主成分綜合打分的方法篩選出各指標中對風味貢獻率較大的化合物。通過聚類分析選出5個主要風味物質，分別為蛋氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、果糖及葡萄糖，以此建立聚類分析模型，并應用用于濃縮蘋果汁樣品感官評定分析，增加了濃縮蘋果汁風味品質的判定的客觀性和準確性，極大地提高了蘋果汁風味判別結果的可靠性，同時也為生產者合理調整工藝提供一定的理論參考。