地衣芽胞桿菌α-淀粉酶耐熱耐酸突變體的酶學性質

劉雪蓮，申培立，牛丹丹，金鵬，田康明，王正祥*

1(天津科技大學 化工與材料學院，天津， 300457)2(天津科技大學 生物工程學院，天津， 300457)

地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase, BLA，EC 3.2.1.1)，是我國淀粉液化酶中最具代表性的高溫α-淀粉酶，可在高溫(105～107℃)下作用于淀粉乳，隨機切割淀粉分子內部α-1,4糖苷鍵生成短鏈糊精、麥芽寡糖和少量葡萄糖，廣泛應用于淀粉糖、酒精、味精、有機酸、醫藥、紡織和造紙等行業，是研究最早、最重要的工業酶制劑之一，占淀粉酶系市場份額的30%左右[1-3]。

在BLA的研究與開發進程中，我國學者前期重點研究了BLA的編碼基因特征、表達方式、酶學性質的分子進化、高效表達與發酵生產工藝技術的優化等[4-6]，有力地推動了我國高溫α-淀粉酶的工業化生產技術的進步，特別是BLA的工業發酵水平得到顯著提升[7]。但是，淀粉液化生產實踐要求BLA能夠具有更好的耐熱性和在酸性條件下更高的活性，如淀粉噴射液化溫度能夠達到110℃以上，液化能夠在pH 5.0或更低的pH值下進行。圍繞這一生產實踐要求，國內外學者進行了大量的有益研究。其中代表性的研究成果包括：(1)運用定點突變或易錯PCR技術，獲得BLA的耐酸、耐熱或比酶活提高的突變體[8]；(2)通過微生物分離與篩選，獲得耐酸、耐熱或比酶活提高的天然BLA分子[9]；(2)通過DNA體外隨機重排技術(DNA shuffling)或結構域替換，優化α-淀粉酶的應用酶學屬性[10]。

本實驗室前期通過DNA體外隨機重排技術獲得以BLA為基礎的高溫α-淀粉酶突變體庫，在此基礎上，本研究從突變體庫中遴選出一耐熱和耐酸性能顯著改善的BLA突變體，并就其酶學性質進行較全面的分析。研究結果將有助于后續高溫α-淀粉酶高產新菌種的構建與工業應用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

表達BLA突變體的重組大腸桿菌，采用EscherichiacoliJM109為宿主細胞、pHY-WZX為表達質粒[11]進行構建，由本實驗室前期構建與保藏。地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)CBBD302用于突變酶的制備，為本實驗室前期構建與保藏[7]。

1.2 酶與試劑

高溫α-淀粉酶(40 000 U/mL)，由地衣芽胞桿菌生產，山東隆科特酶制劑公司；限制性內切酶、蛋白分子質量標準、BSA等，寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒，Omega Bio-tec；胰蛋白胨、酵母浸粉，英國OXOID公司；硫酸卡那霉素購自，生工生物工程有限公司，可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 培養基

淀粉培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 5，可溶性淀粉10，加入2%的瓊脂為固體培養基。必要時，培養基中添加終質量濃度50 μg/mL硫酸卡那霉素。

發酵培養基(g/L)：乳糖20，棉子粉20，CaCl20.3，(NH4)2SO43，K2HPO420，KH2PO410；pH 7.2。

1.4 遺傳轉化

大腸桿菌質粒DNA的提取、酶切、轉化及轉化子篩選等，均采用實驗室常規方法[12]，使用試劑盒時按照試劑盒說明書進行。地衣芽胞桿菌遺傳轉化與篩選，按照文獻[11]描述的方法進行。

1.5 酶液制備、純化與鑒定

挑取3～4個單菌落于50 mL液體培養基中，在37℃、220 r/min條件下培養15～16 h至對數生長期，按照10%的接種量轉接發酵培養基，在37℃、220 r/min條件下培養5 d，離心收集上清即為粗酶液。將粗酶液經用飽和度為30%～50%(4 ℃)(NH4)2SO4分級沉淀，再經凝膠層析柱Superdex-G75純化，通過酶活測定和SDS-PAGE方法分析純化情況，其中SDS-PAGE使用12%分離膠和5%濃縮膠。蛋白濃度測定采用Bradford法進行[13]。

1.6 酶活測定

高溫α-淀粉酶的酶活測定，按照GB/T 24401—2009方法進行。酶活單位(U)定義為：1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，于70 ℃、pH 6的條件下，1 min液化1 mg可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以U/g(或U/mL)表示[14]。

1.7 酶學性質分析

1.7.1 最適溫度及熱穩定性

在pH 6.0下，分別測定酶樣在50、60、70、80、90和100℃下的酶活，以最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活，確定最適反應溫度。將酶樣分別在75、80、85和90 ℃下熱處理60 min，每隔10 min取樣，按上述酶活測定方法測定殘余酶活，以未經處理的酶樣酶活為100%，確定酶的熱穩定性。

1.7.2 最適pH及pH穩定性

在最適反應溫度下，用pH 4.0～8.0的緩沖液適當稀釋酶液，測定對應pH條件下的酶活，以最高酶活為100%，計算其他pH條件下的相對酶活，確定最適反應pH。將酶樣加入不同pH(pH 4～8)緩沖液中室溫(25℃)放置1 h，然后按上述酶活測定方法測定殘余酶活，以未經處理的酶樣酶活為100%，確定其pH穩定性。

1.7.3 金屬離子及相關化學試劑對酶活的影響

配制不同金屬離子溶液(Na+、K+、Li+、Ni+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Sr2+)和化學試劑(EDTA、SDS)，將酶液與金屬離子溶液和化學試劑等體積混合，使酶液中各金屬離子濃度為1、5 mmol/L；4 ℃放置過夜(16 h)后，按上述酶活測定方法測定樣本酶活，以添加等體積緩沖液的酶樣酶活為100%，確定不同金屬離子及化學試劑對酶活的影響。

1.8 酶動力學參數測定

分別以6、8、12、14、16、20 g/L的淀粉溶液為底物，按照GB/T 24401—2009方法，在最適反應條件下測定酶活，采用雙倒數法作圖(Lineweaver-Burk法)并進行酶反應動力學參數計算。

2 結果與分析

2.1 高溫α-淀粉酶V-2的制備與純化

對BLA為基礎的高溫α-淀粉酶突變庫進行篩選，獲得在高溫酸性條件下酶活較高的突變體V-2；進一步純化對應菌株中的質粒DNA，轉化入地衣芽胞桿菌，獲得轉化子H-311(數據未呈現)。經搖瓶發酵120 h，離心收集上清酶液，再經(NH4)2SO4分級鹽析和凝膠過濾色譜進行純化，結果如圖1所示。純化后的突變體V-2的比酶活為1 630 U/mg，在SDS-PAGE上呈現為單條蛋白條帶，分子質量約為56 ku，達到后續酶學性質分析要求的純度。就比酶活而言，突變體V-2較BLA提高約0.6倍[7]。

M-蛋白質標準樣品；1-對照；2-粗酶液；3-純化后的V-2

2.2 高溫α-淀粉酶V-2的酶學性質

2.2.1 最適作用溫度

在pH 6.0的條件下，測定50～100℃高溫α-淀粉酶V-2的酶活，得到溫度對酶活力影響曲線，如圖2所示。突變體V-2的最適作用溫度為80℃，較BLA提高了10℃；當反應溫度由80℃上升到90℃時，BLA酶活力大幅降低，而在同樣條件下突變體V-2仍表現出近71%的最高酶活；在煮沸(100 ℃)條件下，突變體V-2仍具有30%以上的酶活力，而BLA僅存17%的酶活力。可見，相較于BLA，突變體V-2可以在更高的溫度范圍內有效水解淀粉分子。

圖2 溫度對突變體V-2酶活力的影響

2.2.2 最適作用pH

在最適溫度下測定在pH 4.0～8.0高溫α-淀粉酶V-2酶活，獲得了不同pH對酶活力的影響曲線(圖3)?？芍蛔凅wV-2的最適作用pH為pH 5.5，較BLA的最適作用pH降低了0.5～1.0個pH值；突變體V-2在pH 6.5及以上的酶活則明顯低于BLA?？梢?，突變體V-2更適合在酸性條件下發揮淀粉液化作用。

圖3 pH對突變體V-2酶活力的影響

2.2.3 熱穩定性

將酶液在不同溫度(75、80、85和90℃)下保溫60 min，定時取樣分析剩余酶活，獲得圖4所示的酶熱穩定性曲線。突變體V-2在75和80℃條件下穩定性良好，在85或90℃孵育1 h后仍分別保留80%和31%的酶活力；其熱穩定性顯著優于BLA(BLA在75、80和85℃下保溫1 h后，酶活分別保留89%、74%和26%；在90℃條件下處理30 min，酶活力幾近喪失)?？梢钥闯?，突變體V-2的熱穩定性較BLA顯著提升。

圖4 突變體V-2的熱穩定性

2.2.4 pH穩定性

將酶液在不同pH緩沖液中室溫放置1 h后測其剩余酶活，結果如圖5所示。突變體V-2在所測試的pH緩沖液(pH 4.0～8.0)中，皆具有良好的穩定性；在pH 4.0下的穩定性顯著優于BLA(BLA在pH 4.0條件下放置1 h，酶活僅剩31%)。

圖5 突變體V-2的pH穩定性

2.2.5 金屬離子和化學試劑對酶活的影響

將酶液與不同金屬離子或化學試劑等體積混合，使酶液中金屬離子濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，研究其對酶活的影響，結果如表1所示。與BLA不同，所測試的15種常見金屬離子和2種化學試劑對突變體V-2的酶活力皆無明顯促進作用。Cu2+、Fe2+、Fe3+和Al3+對突變體V-2有明顯的抑制作用，但在相同濃度下，其抑制作用低于對BLA的抑制作用。此外，EDTA顯著抑制BLA酶活，突變體V-2對EDTA的敏感性明顯低于BLA。

表1 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

2.3 高溫α-淀粉酶V-2動力學特征

以不同質量濃度(6～20 g/L)的可溶性淀粉為底物，在酶最適溫度和最適pH下測定突變體V-2酶活，采用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，以底物濃度的倒數1/[S]為橫坐標，酶活的倒數1/[V]為縱坐標，求得突變體酶動力學相關特征參數(表2)。突變體V-2的Km值和Vmax值分別為34 mg/mL和151.5 mg/(mL·min)，與BLA差別不顯著，但其催化水解淀粉的效率顯著提升，較BLA提高了約33倍(表2)。

表2 突變體V-2的酶學動力學參數

3 結論

高溫α-淀粉酶是淀粉加工與轉化中不可或缺的核心淀粉酶制劑，其高效工業應用價值除了通過高效表達獲得低成本制造的酶制劑外，進一步提升應用屬性是決定其工業應用價值的關鍵。本文從前期建立的以地衣芽胞桿菌α-淀粉酶為基礎的突變體庫中鑒定出的高溫α-淀粉酶突變體V-2，其最適作用溫度較BLA提高了10℃，最適作用pH降低了0.5～1.0個pH值，并且此突變體可以在更高的溫度和更低的pH下表現出更好的酶活力。這一研究結果可為后續此突變體的高效表達奠定堅實的理論基礎和材料支撐。