尖葉假龍膽對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

付強，王曉雨，李冀

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

冠狀動脈缺血性心臟病是指冠狀動脈供血減少而心肌耗氧量不斷增加，導致血液以及氧氣的供需失衡引起的心臟疾病，治療則主要是以恢復冠狀動脈的血液灌注，有效減少缺血性心臟病的損傷為目的。然而研究發現心臟組織在恢復血液灌注后，會加重心臟組織的損傷，導致大量心肌細胞的死亡，損傷比灌注前更加嚴重，最終造成心臟的損傷，影響其整體功能。即出現心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)這一現象。尖葉假龍膽，別名為苦龍膽，鄂倫春族和鄂溫克族獵民稱其為“穩心草”[1]，使用其全草泡水或者直接嚼服作為治療以及預防心臟病的一種特效藥物。武氏等[2]為闡述尖葉假龍膽抗心律失常的作用，對其主要成分雛菊葉龍膽酮(bellifolin)進行研究，實驗證實bellifolin對大鼠心電圖產生了影響，能夠減慢心律，縮短P-R間期等。但對尖葉假龍膽含藥血清的心肌保護作用尚未進行相關研究。因此，本實驗建立在以往實驗的基礎上，旨在探討尖葉假龍膽含藥血清是否對MIRI的心肌具有保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材

課題所用藥材購內蒙古根河市，經黑龍江中醫藥大學藥學院藥用植物教研室樊銳鋒副教授鑒定尖葉假龍膽全草。樣品標本儲存在黑龍江中醫藥大學方藥分析實驗室。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠30只，體質量(220±20)g，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物合格證號為：SCXK(黑)2013-2014。飼養環境：自由飲食、飲水，溫度(23±2)℃；相對濕度(55±15)%；實驗室風速：0.1～0.2 m/s。

1.3 儀器與試劑

Langendorff灌流設備、BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；Glmour 2000型全自動生化儀(美國M.D.儀器公司)；多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；H-500型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；2135型切片機(德國萊卡公司)；Moticam3000顯微攝影成像系統、Motic image advanced 3.2病理圖像分析系統(麥克奧迪實業集團有限公司)；CAT、MDA、IL-1β、TGF-β試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 溶液的配制

KH液的配制(pH7.4，37 ℃)：NaCl 120 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl21.25 mmol/L，Glucose 11 mmol/L。氧飽和KH液中混入95% O2和5% CO2；缺氧KH液中混入95% N2和5% CO2。

2 實驗方法

2.1 實驗分組以及給藥情況

30只SD大鼠隨機分為3組，每組10只，分組情況以及給藥處理情況如下。

(1)正常對照組(Control組):取出心臟后，置于Langendorff裝置上，給予氧飽和的KH液持續灌流30 min穩定后，繼續給予氧飽和的KH液持續灌流150 min。

(2)心肌缺血再灌注損傷模型組(I/R組)：取出心臟后，置于Langendorff裝置上，給予氧飽和的KH液持續灌流30 min穩定后，給予缺氧KH液灌流30 min，給予氧飽和的KH液120 min。

(3)尖葉假龍膽組(I/R+GEN組)：取出心臟后，置于Langendorff裝置上，給予氧飽和的KH液持續灌流30 min穩定后，給予缺氧KH液灌流30 min，給予混有濃度3 g·kg-1·h-1尖葉假龍膽氧飽和的KH液120 min。

2.2 藥材提取與制備

使用75%乙醇浸泡干燥尖葉假龍膽全草(二者體積比為10:1)，常溫浸泡5 h后，加熱至55 ℃回流1 h，繼續加入75%乙醇，加熱回流1 h，過濾，兩次的濾液合并，減壓干燥回收乙醇，濃縮至1 g·mL-1。根據各組給藥劑量進行配比。

2.3 造模方法

造模方法參考徐淑云[3]、張昱[4]文獻報道進行，整個過程要求操作迅速。然后根據不同組別給予不同的灌注方案。

2.4 指標檢測

2.4.1 心肌組織的病理形態學影響

再灌注結束后，迅速解剖取出大鼠心臟，用預冷的PBS液將表面清洗干凈，并去除心臟上的脂肪組織以及結蹄組織，用濾紙吸干，沿著心肌纖維方向切取大鼠心尖部位5 mm的心肌組織，將其切成大約1 mm×1 mm×2 mm的小塊，放入 4%戊二醛固定液中，在4 ℃冰箱中貯存過夜。依次經過脫水、浸透、包埋、切片、電子染色，最后透風自然晾干后置于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.2 CK-MB的含量測定

再灌注結束后收取冠脈流出液，放入-80 ℃冰箱內凍存備用，測定前37 ℃水浴，根據CK-MB試劑盒說明書對冠脈流出液中二者含量進行測定，上全自動生化儀，在340 nm波長出測定各組吸光度值，測定各組中CK-MB的含量變化。

2.4.3 心肌組織中丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、白細胞介素(IL-1β)、轉化生長因子(TGF-β)的測定

再灌注結束后，用預冷的PBS液(pH7.4)將表面清洗干凈，并去除心臟上的脂肪組織以及結締組織，用濾紙吸干，切下左心室部分心肌組織，稱重。放入PBS(pH7.4)中，部分用液氮保存備用，部分準備制作心肌組織勻漿。按照組織與冰生理鹽水1:9的比例倒入生理鹽水，在冰水浴的條件下制作組織勻漿，首先使用電動玻璃勻漿機制備出心肌組織勻漿，用低溫離心機(參數為：溫度為4 ℃，3 500 r/min)進行離心15 min，吸取離心后的上清液，分裝在EP管中-80 ℃冰箱保存備用。按照南京建成生物工程研究所的MDA、CAT、IL-1β 、TGF-β試劑盒說明進行操作。

2.5 統計學分析

3 實驗結果

3.1 CK-MB含量的變化

與Control組比較，I/R組、I/R+GEN組大鼠心肌組織中CK-MB含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+GEN組CK-MB含量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表1、圖1所示。

表1 尖葉假龍膽對心臟冠脈流出液CK-MB含量的影響

圖1 尖葉假龍膽對心臟冠脈流出液CK-MB含量的影響

3.2 各組中CAT活性的變化情況

與Control組比較，I/R組、I/R+GEN組大鼠心肌組織中CAT活性明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+GEN組CAT活性顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表2、圖2所示。

表2 尖葉假龍膽對心肌組織CAT活性的影響

圖2 尖葉假龍膽對心肌組織CAT活性的影響

3.3 各組中MDA含量的變化情況

與Control組比較，I/R組、I/R+GEN組大鼠心肌組織中MDA含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+GEN組MDA含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表3、圖3所示。

表3 尖葉假龍膽對心肌組織MDA含量的影響

圖3 尖葉假龍膽對心肌組織MDA含量的影響

3.4 各組中IL-1β含量的變化情況

與Control組比較，I/R+GEN組IL-1β含量變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；與I/R組比較，I/R+GEN組IL-1β含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表4、圖4所示。

表4 尖葉假龍膽對心肌組織IL-1β含量的影響

圖4 尖葉假龍膽對心肌組織IL-1β含量的影響

3.5 各組中TGF-β含量的變化情況

與Control組比較，I/R組、I/R+GEN組大鼠心肌組織中TGF-β含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+GEN組TGF-β含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表5、圖5所示。

表5 尖葉假龍膽對心肌組織TGF-β的影響

圖5 尖葉假龍膽對心肌組織TGF-β含量的影響

3.6 心肌組織超微結果

Control組：心肌肌節纖維排列規則，線粒體以及肌節間結構清晰，基質密度均勻；I/R組：表現為心肌肌節纖維排列紊亂，肌絲發生溶解甚至斷裂。心肌細胞細胞核和線粒體都損傷，線粒體腫脹，嵴結構出現斷裂，染色質濃縮，形成大小和形狀不一的碎片及塊狀；I/R+GEN組：心肌肌節纖維排列相對規則，各結構清晰，損傷的心肌超微結構有所改善。結果如圖6所示。

4 討論

尖葉假龍膽是龍膽科一年生草本植物,又名苦龍膽,蒙藥名為阿古特-其其格,廣泛分布于我國河北、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、山西等地區。其全草入藥,味苦、性涼,具有清熱、利濕的功效,臨床可用于治療黃疸性肝炎、頭痛、發燒等。敖魯古雅鄂侖春族獵民長期用其治療心絞痛等疾病,療效極為顯著[5]。

心肌酶學的改變可以判斷心肌發生損傷的程度，CK-MB是肌酸激酶CK的同工酶，其在心肌組織中的變化特異性較高，故其是檢測心肌是否發生壞死的黃金指標。多項研究結果表明，心肌缺血再灌注發生過程中伴隨著大量的氧自由基(ROS)爆發式產生[6]。丙二醛(MDA)是體內氧自由基攻擊生物膜中的多價不飽和脂肪酸發生脂質過氧化的終產物。丙二醛作為測定脂質過氧化的程度的指標之一[7]，也間接反映出ROS對心肌細胞的損傷程度[8]。過氧化氫酶(CAT)活性的變化可反映機體清除ROS、抗氧化損傷的能力。心肌細胞中炎癥因子IL-1β的變化是判斷心血管疾病損傷程度的指標[9]。轉化生長因子(TGF-β)可以使心肌細胞免受IL-1β的損傷，其機制可能與其對IL-1β誘導的NO抑制作用相關。

本研究表明，與Control組比較：I/R組、I/R+GEN組大鼠心肌組織中CK-MB含量明顯升高，證明模型制備成功，造成了心肌損傷的發生；I/R組體現脂質過氧化的程度MDA含量顯著升高，抗氧化損傷指標CAT活性顯著下降，說明造模成功后，心肌損傷嚴重，有氧化應激反應的參與；相關炎細胞因子IL-1β、TGF-β含量升高，在尖葉假龍膽干預后，各組炎癥因子含量降低，證明心肌損傷得到修復，炎癥反應減弱，尖葉假龍膽對心肌缺血再灌注損傷具有修復和保護作用。

與I/R組比較，I/R+GEN組CK-MB含量顯著降低，證明尖葉假龍膽能夠減輕心肌缺血再灌注造成的損傷；CAT活性顯著升高，MDA含量降低，證明尖葉假龍膽能夠抑制氧化應激水平對心肌起到保護的作用。

超微結構說明心肌缺血再灌注損傷能引起大鼠心肌細胞凋亡，發生凋亡特征性的形態學改變。尖葉假龍膽組對心肌缺血再灌注損傷心肌組織具有保護作用。

5 結論

綜上所述，與I/R組比較，尖葉假龍膽組可以使冠脈漏出液中的CK-MB含量明顯降低；使心肌組織中MDA、IL-1β、TGF-β含量明顯降低，CAT活性明顯升高，差異具有統計學意義；有效改善心肌組織的超微結構。說明尖葉假龍膽組能夠抗心肌缺血再灌注造成的損傷，對心肌具有保護作用。