清熱除濕凝膠對SiHa細胞荷瘤鼠的抑瘤作用及對Bcl-2、Bax蛋白的影響

馬秀麗，劉君，李家琦，薛曉鷗*

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100006；3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院順義院區，北京 101300)

宮頸癌(Cervical cancer，CC)是目前全球范圍內威脅女性生命健康全球范圍內威脅女性健康的第四大惡性腫瘤[1]，目前已經證實宮頸高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染是引起宮頸病變甚至發展為宮頸癌的主要原因，其中16和18兩型與CC的發生更為密切[2]。從HR-HPV感染到宮頸病變甚至癌變的機制仍不十分明確，有效防治HR-HPV感染是預防CC發生的關鍵環節和研究熱點。本課題組在前期研究的基礎上對清熱除濕凝膠抑制HR-HPV復制從而抑制腫瘤發生發展的作用進行進一步探索。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級4～5周齡雌性BALB/c裸鼠50只，體質量(15±1)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司(SCXK京2016-0006)，飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心(溫度：23～25℃，濕度：49%～51%)。實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準，批準編號：BUCM-4-2019041002-2041。

1.2 藥品及試劑

清熱除濕凝膠(百川飛虹技術有限公司)，注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)，重組Anti-Bax、Anti-Bcl-2抗體(美國Abcam公司)，生物素標記山羊抗兔(北京碧云天生物技術有限責任公司),抗體稀釋液、DAB顯色液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。

1.3 實驗儀器

細胞培養箱(Thermo公司)，生物安全柜(ESCO公司)，倒置相差顯微鏡(Motic公司)，離心機(Sigma公司)，高精度電子稱重天平(英衡公司),游標卡尺(得力公司)，顯微鏡(麥克奧迪實業集團公司)。

2 方法

2.1 宮頸癌SiHa細胞懸液制備

宮頸癌SiHa細胞株復蘇后進行培養、擴增，培養條件是培養條件是10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的MEM(EBSS)培養液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養。取對數生長期的SiHa細胞，常規消化，用MEM(EBSS)培養基重懸清洗，離心，2遍，計數，調整細胞懸液濃度為2×107/mL，放置于冰上轉運，備用。

2.2 造模與分組

雌性5周齡裸小鼠，2×107/mL細胞懸液充分混勻，用1 mL注射器抽取細胞懸液，將細胞懸液注入裸小鼠右前腿外上方皮下，0.2 mL/只。細胞懸液注入后可見以注射部位為中心的圓形隆起，每日觀察記錄注射區域變化，以注射部位出現平均直徑≥0.5 cm質硬腫物為造模成功。造模成功后按腫瘤體積大小，用隨機數字法將荷瘤小鼠分為5組，每組10只，開始干預。

2.3 各組給藥方法

模型組：常規飼養；卡波姆940組：卡波姆940(外涂,0.15 mL/50 mm3/d)；中藥組：清熱除濕凝膠(外涂,0.3 mL/50 mm3/d)；順鉑組：順鉑注射液(腹腔注射,0.2 mL/10 g/3 d)；聯合用藥組：清熱除濕凝膠(外涂,0.3 mL/50 mm3/d)+順鉑注射液(腹腔注射,0.2 mL/10 g/3 d)，共給藥28 d。

2.4 觀察指標

觀察不同組別荷瘤小鼠精神狀態，飲食、攝水及體質量變化，干預第7、14、21、28天用游標卡尺測量荷瘤小鼠體表腫瘤長徑(a)及短徑(b)，計算腫瘤體積，腫瘤體積(V)=ab2/2，觀察腫瘤生長趨勢。HE染色觀察腫瘤組織病理形態。免疫組化法檢測腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達情況。具體步驟參照說明書操作。

2.5 結果判定標準

在顯微鏡下觀察每張切片(200×)，以細胞質或者細胞核內出現棕黃色顆粒為Bax及Bcl-2陽性細胞，取5個互不重復的視野進行拍照，應用Image-proplus軟件圖片進行分析，取5個視野的平均值進行統計分析。

2.6 統計方法

3 結果

3.1 一般情況觀察

造模后，裸小鼠精神狀態良好，干預后順鉑組和聯合用藥組與其它三組比較，在給藥第二周起逐漸出現不同程度飲食、攝水量減少，體質量生長緩慢甚至負增長，部分荷瘤小鼠消瘦、脊柱及肋骨清晰可見，順鉑組更為明顯，順鉑組與聯合用藥組分別于干預第20天，第27天死亡一只，死亡前荷瘤小鼠均出現體質量明顯負增長，對其進行解剖，心臟、肺、肝、腎等臟器未見明顯異常，考慮為順鉑毒副作用及體質量過低所致，其余各組一般狀況良好。見表1。

表1 各時間節點荷瘤小鼠體質量變化情況

3.2 腫瘤生長情況

用藥干預后，中藥組、順鉑組、聯合用藥組與模型組比較腫瘤生長均受到抑制(P<0.05)；聯合用藥組、順鉑組與模型組、中藥組比較，用藥第7天腫瘤體積減小(P<0.05)，聯合用藥組抑制腫瘤生長速度較順鉑組在用藥第14天出現優勢(P<0.05)；中藥組與模型組、卡波姆940組比較在用藥7 d后腫瘤生長趨勢略減緩(P>0.05)，第14天腫瘤體積明顯減小(P<0.05)；卡波姆940組與模型組比較，腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各時間節點荷瘤小鼠腫瘤生長情況

3.3 腫瘤組織病理學觀察

荷瘤小鼠腫瘤組織呈圓形或橢圓形生長，模型組、卡波姆940組荷瘤小鼠腫瘤組織可見明顯結節，質偏硬，活動度可，同時上述兩組腫瘤組織周圍可見明顯血管生成，血運較其它組明顯。解剖見各組腫瘤組織包膜完整，與周圍組織邊界清楚，無粘連，易剝離，組織切面呈魚肉樣，部分腫瘤組織切面中心位置可見液性壞死。鏡下見，各組腫瘤組織細胞排列紊亂、擁擠，無極性，細胞大小、形態各異，細胞核增大，核質比例顯著增大，核形不規則，染色較深，核分裂相多見。與模型組、卡波姆940相比，各用藥組均可見不同程度細胞壞死形成的炎性反應細胞聚集區域，成片狀分布。見圖1。

注：A1、A2模型組，B1、B2卡波姆940組，C1、C2中藥組，D1、D2順鉑組，E1、E2聯合用藥組。圖1 各組腫瘤組織HE染色圖

3.4 清熱除濕凝膠對Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達的影響

由表3可知，中藥組、順鉑組、聯合用藥組與模型組、卡波姆940組比較Bcl-2均降低，Bax均升高，以聯合用藥組表現最明顯(P<0.05)；卡波姆940組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。提示清熱除濕凝膠有下調Bcl-2蛋白，上調Bax蛋白表達的作用，見圖2～3。

表3 藥物干預后腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白表達情況

注：A模型組，B卡波姆940組，C中藥組，D順鉑組，E聯合用藥組。圖2 各組腫瘤組織免疫組化Bcl-2染色圖(200×)

注：A模型組，B卡波姆940組，C中藥組，D順鉑組，E聯合用藥組。圖3 各組腫瘤組織免疫組化Bax染色圖(200×)

4 討論

HR-HPV持續感染是導致宮頸癌的主要原因，治療HR-HPV持續感染狀態逆轉其引起的宮頸病變級別是預防宮頸癌發生的關鍵[3]，而HPV病毒本身的種屬特異性及嗜上皮特性目前難以離體培養進行研究，故選用HR-HPV16陽性SiHa細胞構建宮頸癌荷瘤小鼠模型用于后續研究。中醫學中無宮頸HPV感染及宮頸癌的記載，根據其帶下量多或夾膿血、異味等臨床表現歸屬于帶下病范疇。“清熱除濕凝膠”源于我國名老中醫郭志強教授治療濕熱下注型帶下病、宮頸炎的散劑經驗方劃裁而來，臨床應用中發現其有治療HPV感染的作用。后經過薛曉鷗教授團隊對處方和劑型進行改革后加入基質卡波姆940而成凝膠劑，具有較好的黏附性，使用方便，作用持久等優點。組方主要藥物包括紫草、金銀花、莪術、苦參、黃柏、白及、百部、冰片、兒茶等。君藥紫草清熱解毒、涼血活血；臣藥金銀花、莪術、苦參、黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，殺蟲止癢，活血祛瘀；佐藥白及、百部、冰片，收澀止癢，止痛防腐，斂瘡生肌；使藥兒茶生肌祛濕。君臣相須為用，主癥與兼癥并顧，佐使藥各司其職，使藥效所到之處濕得清，熱得除，毒得解，帶下自止，創面收斂愈合，陰癢等不適癥狀緩解，全方共奏清熱除濕止帶、殺蟲止癢斂瘡。團隊在前期已經對其抑瘤作用進行了初步探索，體外實驗研究表明，清熱除濕凝膠可抑制人宮頸癌Siha增殖，并誘導其凋亡，進一步體內實驗發現，其對Siha細胞荷瘤小鼠腫瘤生長具有明顯抑制作用，其作用機制可能與下調致癌蛋白E6/E7的表達，磷酸化ERK/P38 MARK信號轉導通路有關[4-6]。

腫瘤性疾病的發生是細胞凋亡機制放松調節的一個標志，使部分異常或衰老細胞發生免疫逃逸，進入無限增殖狀態，細胞凋亡的改變不僅與腫瘤的發生、發展有關，同時與近年來發生的腫瘤治療的耐藥性有關[7]，Bcl-2家族成員是線粒體凋亡途徑的重要調控者[8]，根據其功能不同可分為抗凋亡蛋白家族和促凋亡蛋白家族，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白家族的主要代表成員，Bax是促凋亡蛋白家族主要代表蛋白之一[9]。研究表明，Bcl-2蛋白在諸多腫瘤細胞中高表達，且是線粒體凋亡突降的主要抗凋亡蛋白，在腫瘤細胞的凋亡調控中發揮著重要作用[10]。Bcl-2/Bax比值變化可影響其下游因子的表達,影響線粒體通路是否正常發揮作用[11]。近年來，中醫藥在腫瘤性疾病促凋亡及耐藥性方面研究越來越多，中藥治療腫瘤性疾病是當今醫學研究熱點之一。

本研究通過荷瘤小鼠模型觀察清熱除濕凝膠對宮頸癌的抑制作用及機制，結果發現清熱除濕凝膠在給藥一周后腫瘤生長速度較模型組及卡波姆940組生長速度減緩，用藥第二周腫瘤生長趨勢明顯減緩，隨著用藥時間的延長，腫瘤抑制作用明顯，同時用藥期間荷瘤小鼠日常精神狀態可，活動自如，飲食、攝水情況尚可，體質量增長平緩，無明顯體質量下降情況未發生死亡，提示其在抑瘤的同時可保證荷瘤小鼠的生活質量。當清熱除濕凝膠與順鉑聯合應用時抑瘤效果更明顯。通過對Bcl-2、Bax蛋白檢測發現，清熱除濕凝膠可下調Bcl-2蛋白表達的同時上調Bax蛋白表達，Bcl-2、Bax蛋白表達關系發生變化，從而影響下游相關蛋白表達可能是其抑制腫瘤生長的機制之一。這與文獻報道一些清熱除濕中藥在抑瘤作用方面對Bcl-2和Bax調節作用相符[12-14]。本研究證實清熱除濕凝膠能夠抑制裸鼠HR-HPV16陽性SiHa細胞移植瘤的增殖，并且部分作用機理可能與藥物改變了癌癥相關蛋白Bcl-2和Bax的表達有關。為中醫藥防治HPV感染導致腫瘤奠定研究基礎。