地西他濱誘導人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡機制的研究

張剛　高曉慧　吳海兵　趙曉燕　顏敏超　李園　曾惠　郭曉珺

[摘要] 目的 研究地西他濱誘導人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡的機制。 方法 常規體外培養人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞株，取對數生長期的細胞傳代24 h后加入不同濃度（0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L）地西他濱處理，分別繼續培養24、48、72 h后，用CCK-8法測定細胞增殖活性;倒置顯微鏡下觀察細胞形態;Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術檢測地西他濱作用后人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞株的凋亡率;應用透射電鏡觀察人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞發生凋亡的形態學特征;實時熒光定量Real time-PCR法檢測凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2在mRNA水平表達變化的情況。 結果 地西他濱可以抑制Jurkat細胞增殖，并且呈濃度和時間依賴性（P<0.05）。倒置顯微鏡觀察到地西他濱作用后細胞形態發生了顯著改變;流式細胞術檢測細胞凋亡的結果表明地西他濱能夠誘導人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡并且呈濃度依賴性（P<0.05）;透射電鏡觀察結果證明地西他濱可以誘導人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞出現凋亡性細胞死亡，5.0 μmol/L地西他濱作用Jurkat細胞72 h后出現大量凋亡小體。另外，Real time-PCR實驗研究結果發現地西他濱能夠上調促凋亡基因Caspase-3的表達，下調凋亡抑制基因Bcl-2的表達。 結論 地西他濱能通過上調促凋亡基因Caspase-3的表達和下調凋亡抑制基因Bcl-2的表達誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] 地西他濱;急性淋巴細胞白血病;Jurkat細胞;凋亡

[中圖分類號] R733.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）01-0026-05

Study on the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells

ZHANG Gang1? ?GAO Xiaohui2? ?WU Haibing1? ?ZHAO Xiaoyan1? ?YAN Minchao1? ?LI Yuan1? ?ZENG Hui1

GUO Xiaojun1

1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314000， China; 2.Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells. Methods Human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line was routinely cultured in vitro. cells were harvested in logarithmic growth phase， and then treated with different concentrations （0.5， 1.0， 5.0 and 10.0 μmol/L） of decitabine after passage for 24 h. The cells were cultured continuously for 24， 48， and 72 hours respectively. The cell proliferation activity was measured by CCK-8 method. Cell morphology was observed under inverted microscope. Annexin V-FITC/PI staining flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line after decitabine treatment. The morphological characteristics of apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells were observed by transmission electron microscopy. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of apoptosis-related genes Caspase-3 and Bcl-2. Results Decitabine inhibited Jurkat cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner （P<0.05）. Inverted microscopy showed significant changes in cell morphology after decitabine treatment. Flow cytometry detection of apoptosis showed that decitabine can induce apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells in a concentration-dependent manner（P<0.05）. Transmission electron microscopy showed that decitabine can induce apoptotic cell death in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells， and a large number of apoptotic bodies appeared in Jurkat cells treated with 5.0μmol/L decitabine for 72 h. In addition， real time-PCR experimental results showed that decitabine can up-regulate the expression of the proapoptotic gene Caspase-3 and down-regulate the expression of the apoptosis-inhibiting gene Bcl-2. Conclusion Decitabine can induce apoptosis of cells by up-regulating the expression of apoptosis-promoting gene Caspase-3 and down-regulating the expression of apoptosis-inhibiting gene Bcl-2.

[Key words] Decitabine; Acute lymphoblastic leukemia; Jurkat cells; Apoptosis

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是由于原始淋巴細胞及幼稚淋巴細胞在造血組織異常增殖，并浸潤全身各組織臟器（尤其是肝、脾、淋巴結、腦脊液、睪丸、胸腺等組織臟器）的一種常見血液系統惡性腫瘤[1]。在兒童與成人群體中均可發病，目前已經成為兒童期最常見的惡性腫瘤[2]。而且ALL是全球范圍內發病率高、致死率高的惡性腫瘤之一，僅僅在美國每年有大約27 000例被診斷為ALL，12 000例因ALL死亡[3]。隨著診斷技術水平的不斷提高及治療方案的不斷更新，特別是造血干細胞移植技術在臨床上的廣泛應用，ALL患者的治愈率有了明顯提高[4]。盡管如此，仍有20%的患者將會面臨復發、死亡等風險[5]。因此，尋找一種更有效的抗ALL治療方法至關重要。

目前地西他濱（decitabine，DAC）在治療成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）等惡性疾病方面在臨床上已得到了廣泛的認可及推廣[6-7]，但在臨床上尚未用于急性淋巴細胞白血病的治療。本研究中我們依據現有的研究結果，結合當前抗急性淋巴細胞白血病研究的新熱點，探討了地西他濱是否具有誘導人ALL Jurkat細胞凋亡的作用及其可能的分子機制，為ALL的治療提供新靶點、新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

地西他濱（江蘇正大天晴藥業股份有限公司）溶于生理鹽水，-20℃保存，使用時用生理鹽水稀釋至工作濃度;人ALL Jurkat細胞、青霉素、鏈霉素、70%乙醇、0.25% Tripsin-EDTA、PBS、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、50×TAE電泳緩沖液（江蘇凱基生物技術股份有限公司）;Cell Counting Kit-8（日本 DOJINDO Laborataries）;RPMI-1640培養基（美國 GIBCO）;FBS（美國 ExCell Biology）;氯仿、異丙醇（中國 京化學試劑有限公司）、cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq DNA Polymerase（美國 Thermo Fisher）、96 wellcell culture plate、6 wellcell culture plate、24 wellcell culture plate（美國 Corning Incorporated）;超凈工作臺（中國 蘇州凈化）;通風櫥（中國 蘇州億達）;CO2培養箱（日本 SANYO）;2.5 μL、10 μL、200 μL、1000 μL移液器（德國 eppendorf）;生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）;振蕩器（中國 上海滬西分析儀器廠）;臺式低速離心機（中國 上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠）;立式壓力鍋（中國 上海博訊）;電熱鼓風干燥箱（中國 上海圣欣）;酶標儀（美國 BioTek）;恒溫水浴箱（中國 常州國華電器有限公司）;高速冷凍離心機（德國 Sorvall）;多用脫色搖床（中國 江蘇金壇市正基儀器廠）;紫外光度儀（日本SHIMADZU）;普通梯度PCR儀（美國 ABI Veriti 96 well Thermal cycler）;熒光定量PCR循環儀（中國 中山達安）。

1.2 培養細胞

將符合細胞計數要求的ALL Jurkat細胞株懸液分裝入含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養基的培養瓶內，并將培養瓶放在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養。每2～3天更換1次細胞培養基并傳代一次，并取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數生長期的ALL Jurkat細胞株接種于96孔細胞培養板中，每孔細胞數調整為5×104個，每孔加入200 μL相應的含有不同濃度地西他濱的培養基，使地西他濱終濃度分別為0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L，并設立未加藥的陰性對照組，每種濃度設5個復孔。置于37℃，5% CO2培養箱中培養24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱內繼續培養3 h，搖床10 min輕輕混勻;λ=450 nm，酶標儀讀出每孔的OD值，計算抑制率;IR（%）=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%，計算各組別抑制率及藥物IC50。

1.4 倒置顯微鏡觀察Jurkat細胞形態的變化

取對數生長期的ALL Jurkat細胞株接種于96孔細胞培養板中，每孔細胞數調整為5×104個，每孔加入200 μL相應的含有不同濃度地西他濱的培養基，使地西他濱終濃度分別為0.5 μmol/L和5.0 μmol/L，并設立未加藥的陰性對照組，每種濃度設5個復孔。置于37℃，5% CO2培養箱中繼續培養72 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態及形態學改變。

1.5 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

按試劑盒說明書進行操作，取對數生長期的ALL Jurkat細胞株接種于6孔板中，培養24 h后，根據組別設置分別加入地西他濱終濃度分別為0.5 μmol/L和5.0 μmol/L的培養基，并設立未加藥的陰性對照組;藥物作用72 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞;用PBS洗滌細胞2次（離心2000 rpm，5 min）收集5×105細胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI（Propidium Iodide），混勻;室溫、避光、反應5～15 min，加入結合緩沖液后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的情況。

3 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，細胞凋亡過程相當復雜，有多條信號通路及多基因參與，其中Bcl-2和Caspase系列基因被稱為是最經典的細胞凋亡通路[8]。Bcl-2家族是一類在細胞凋亡信號途徑中發揮重要作用的蛋白質，Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的凋亡抑制基因，在很多惡性腫瘤中大量表達（如胃癌、白血病等），且在腫瘤細胞凋亡過程中發揮了重要的調控作用[9]。因為抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體時具有抑制Bax蛋白活性的功能，所以當Bax形成同源二聚體時具有誘導細胞凋亡的活性，同時Bcl-2蛋白表達量也會增加，而當同源二聚體Bax分開，其與Bcl-2形成異源二聚體時，則能夠抑制細胞凋亡[10-11]。Czabotar PE等[12]研究結果顯示Bcl-2具有通過促進細胞生存的途徑從而抑制細胞凋亡的作用，且過度表達將會使正常機體內細胞凋亡，降低發生腫瘤的風險。Caspase-3是蛋白凋亡家族Caspase中的重要一員，其本質是一種核酸內切酶，具有執行細胞凋亡的功能，當Caspase-3蛋白酶活性被激活后，細胞就會發生不可逆的凋亡[13-14]。研究表明，在多種腫瘤細胞發生凋亡時，Caspase-3蛋白都會出現表達上調[15-16]。相關研究結果顯示通過誘導白血病細胞凋亡的方法治療白血病與應用傳統抗腫瘤化療藥物相比具有毒副作用更小、療效更加顯著的優勢[17]，所以積極探尋誘導白血病細胞凋亡的新型藥物是目前治療白血病主要研究熱點、方向。

地西他濱（decitabine，DAC）是一種表觀遺傳學抑制劑，主要是通過磷酸化后直接摻入DNA，抑制DNA甲基化轉移酶，引起DNA低甲基化從而恢復控制細胞分化增殖基因的正常功能來發揮抗腫瘤作用。目前地西他濱（decitabine，DAC）在治療成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）方面在臨床上已得到了廣泛的應用，且已有研究報告顯示地西他濱對K562、MEL、S579等細胞株都具有抑制增殖、誘導其凋亡的作用[18]，但關于地西他濱對ALL Jurkat細胞株的作用研究很少，本研究結果表明，不同濃度的地西他濱對ALL Jurkat細胞株均具有不同程度的增殖抑制作用，且隨著地西他濱藥物濃度增加及作用時間延長其抑制作用增強，呈現藥物濃度和作用時間依賴性。通過流式和透射電鏡實驗結果進一步表明了地西他濱具有誘導ALL Jurkat細胞株凋亡的作用，這與王怡等[19]研究結果是相一致的。本研究還發現地西他濱可呈濃度依賴性下調抗凋亡基因Bcl-2表達及上調促凋亡基因Caspase-3在mRNA水平的表達，這與劉進等[20]實驗研究結果是一致的。

綜上所述，地西他濱能夠顯著抑制ALL Jurkat細胞株的增殖，并誘導其凋亡，而下調抗凋亡基因Bcl-2表達和上調促凋亡基因Caspase-3 mRNA的表達水平可能是其分子機制，可為地西他濱應用于ALL 的臨床治療提供實驗理論依據。

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（收稿日期：2019-07-15）