超臨界CO2流體萃取墨紅玫瑰花中鞣質的工藝優化

李金鳳，張旋，陶冬冰

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866）

墨紅，又名朱墨雙輝，學名Rose chinensis Jacq“Crimsin Glory”H.T.[1]，是國內食用玫瑰花種植的主要品種[2]。鞣質是玫瑰花中重要的生理活性物質之一，是以玫瑰為原料加工的食品澀味產生的主要來源[3]，是玫瑰花抗衰老和調節女性內分泌系統的重要抗氧化功能物質之一[4]。目前國內外對鞣質的抗氧化性研究已經十分深入[5]，提取方法多為溶劑提取法、超聲波提取法等，提取率相對較低[6]，造成玫瑰鞣質的利用不高，通常在加工過程中脫澀除去[7]，本文旨在研究以墨紅玫瑰花為原料，利用超臨界CO2萃取技術提高提取鞣質的效率，優化墨紅玫瑰花中鞣質的提取工藝。對玫瑰功能性食品開發起到一定的借鑒意義，為進一步開發高效、高價值的天然食品抗氧化劑、食品添加劑、研制功能性食品及開發醫藥材料提供理論指導[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

本試驗所采用的原料為新鮮的玫瑰花，品種為法國墨紅玫瑰，采于云南七彩云花生物科技有限公司食用玫瑰花基地。

石油醚（30℃～60℃）、氯仿、丙酮、無水乙醇、甲醇（均為 AR 試劑）：國藥集團；鞣花酸（C76H52O46，M=1 701.25）：Sigma 公司。

1.1.2 主要儀器

紫外可見分光光度計（Cary50）：美國Vrian；不銹鋼篩（20、40、60、80、100 目）：日本 AS ONE；超臨界萃取設備（HA121-50-02 型）：南通市華安超臨界萃取有限公司；真空冷凍干燥設備（Freezone2.5）：美國Labconco。

1.2 試驗方法

1.2.1 鞣質的提取方法

1.2.1.1 工藝流程

墨紅玫瑰花→原料預處理（去除花托、留完整花瓣）→烘干→粉碎→預處理（過篩、脫脂）→超臨界CO2萃取→真空抽濾→收集濾液→測定

1.2.1.2 預處理方法

稱取一定量的粉碎過篩后的墨紅玫瑰花粉末，用石油醚在60 ℃回流8 h 進行脫脂，再用氯仿冷浸24 h處理，以除去色素、脂肪等雜質[9]。

1.2.1.3 超臨界CO2萃取方法

準確稱取脫脂后的樣品，裝入萃取釜，密閉，在夾帶劑罐中裝入適量夾帶劑，控制超臨界CO2萃取儀器的萃取溫度、萃取壓力、分離溫度、分離壓力等條件，在超臨界狀態下進行萃取，在一定時間后降壓，從分離柱得到提取液，然后減壓濃縮除去有機溶劑，Folin-Denis法測定鞣質含量，然后真空冷凍干燥得到粗提物[10]。

1.2.2 鞣質的定量方法[11]

鞣質的定量方法采用Folin-Denis 比色法。鞣質類化合物在堿性溶液中，可將磷鎢酸鈉還原并生成藍色化合物，顏色的深淺與鞣質含量正相關，在760 nm 波長比色，以鞣花酸標準品做標準曲線，再根據測得的吸光值在標準曲線上查得對應的鞣質含量。

1.2.2.1 Folin-Denis 顯色劑的配制[12]

50 g 鎢酸納，10 g 磷鉬酸溶于含375 mL 水的燒瓶中，在加入25 mL 85%的磷酸，水浴回流2 h，冷卻后定容至500 mL 棕色容量瓶中保存。

Na2CO3飽和溶液：35 g 無水 Na2CO3于 70 ℃溶解在100 mL 水中，放置過夜。

1.2.2.2 標準曲線的制作

準確配制0.102 mg/mL 的鞣花酸標準溶液，分別吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 標準液加入裝有25 mL 水的50 mL 容量瓶中，再各加2.5 mLFolin-Denis 顯色劑，10 mL Na2CO3飽和溶液，搖勻定容，室溫下放置30 min 后比色，以平均吸光值與標準溶液的濃度作線性回歸分析[13]，得到回歸方程：y=51.929x+0.011 5（R2=0.997 3）。標準曲線圖見圖1。

圖1 Folin-Denis 法測定鞣質含量的標準曲線Fig.1 The calibration curve of tannin content

1.2.3 單因素試驗

稱取玫瑰干粉300 g，分別進行夾帶劑的選擇（70%乙醇、水、50 %甲醇、60 %丙酮為夾帶劑，萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa、萃取時間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[13]；粉碎粒度（原料粒度為 20、40、60、80、100 目，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度60℃、萃取時間1h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[14]；萃取時間（萃取時間為 20、40、60、90、120、150、180 min，70 %乙醇夾帶劑、萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[15]；萃取溫度（20、30、40、50、60、70 ℃，70 %乙醇夾帶劑、萃取壓力20 MPa、萃取時間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[16]；萃取壓力（15、20、25、30 MPa，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度 60 ℃、萃取時間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離溫度40 ℃、分離壓力 8 MPa）[17]；夾帶劑的流速（15、20、30 mL/min，70%乙醇夾帶劑，萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MP、萃取時間1 h、分離溫度 40 ℃、分離壓力 8 MPa）[18]；夾帶劑用量（100、200、400、600、900、1 200 mL 乙醇，萃取溫度 60 ℃、萃取壓力20 MPa、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa時，夾帶劑流量 15 mL/min）[19]；分離溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃，70%乙醇夾帶劑、萃取溫度 60 ℃、萃取時間1 h、夾帶劑流量20 mL/min、分離壓力8 MPa）[20]的超臨界CO2萃取單因素試驗，從分離柱得到提取液，然后減壓濃縮除去有機溶劑，Folin-Denis 法測定玫瑰鞣質含量。

1.2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果確定影響鞣質浸提率的因素主要有萃取壓力（A）、萃取溫度（B），萃取時間（C）、夾帶劑乙醇濃度（D），設計四因素三水平的正交試驗，每個試驗樣品重300 g。

表1 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗表Table 1 The project of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

2 結果與分析

2.1 夾帶劑的選擇

由于鞣質是強極性的物質，而超臨界CO2萃取對弱極性和非極性的物質有較好的萃取效果，所以添加夾帶劑，改變超臨界流體的極性，可以提高鞣質的提取率。夾帶劑選擇試驗結果見表2。

表2 夾帶劑的選擇Table 2 The selection of entrainers

由表2 可知，用70%乙醇和50%甲醇做夾帶劑玫瑰花鞣質的提取率分別為33.10 mg/g 和32.93 mg/g，基本相同，用60%丙酮做夾帶劑，鞣質提取率為34.14 mg/g，略高，水做夾帶劑鞣質的提取率為27.97 mg/g，最低。但丙酮和甲醇都是有毒的有機溶劑，所以選擇乙醇做夾帶劑。

2.2 粉碎粒度對玫瑰花中鞣質提取率的影響

原料粒度對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖2。

圖2 原料粒度對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.2 Extraction effect of tannin from rose by granularity

由圖2 可知，當原料粒度過細時，反而不利于玫瑰花中鞣質的提取，主要是因為原料過細不利于超臨界CO2流體從原料中通過，還可能造成原料堵塞萃取釜的過濾板，使流體進入分離柱的量大大減少，使玫瑰花鞣質的提取率降低。在試驗中還發現，原料目數太高，對儀器的損害很大，減壓時會造成過濾板因內外壓強不同而破裂，原料漏出，清理儀器時很困難，所以本試驗最后選定40 目的原料進行萃取試驗。

2.3 萃取時間對玫瑰花鞣質提取率的影響

萃取時間對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖3。

圖3 萃取時間對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.3 Extraction effect of tannin from rose by time

由圖3 可以看出，當萃取時間低于60 min 時，隨著萃取時間的延長，玫瑰花鞣質的提取率逐漸增高，但超過60 min 后，提高靜萃取時間對玫瑰花鞣質的最終提取率影響并不顯著。這表明在60 min 時間段內萃取劑CO2和夾帶劑乙醇已能較好地滲入玫瑰粉末，因此在以后的萃取過程中，萃取時間定為60 min。

2.4 萃取溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響

萃取溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖4。

圖4 萃取溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.4 Extraction effect of tannin from rose by temperature

由圖4 可知，在溫度小于60 ℃時，玫瑰花鞣質提取率隨溫度升高而增大，即玫瑰花鞣質在超臨界CO2流體中的溶解度隨著溫度的上升而增大，而溫度大于60 ℃以后，鞣質的提取率隨溫度升高反而有減小的趨勢。

2.5 萃取壓力對玫瑰花鞣質提取率的影響

萃取壓力對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖5。

圖5 萃取壓力對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.5 Extraction effect of tannin from rose by pressure

由圖5 可知，隨著萃取壓力增大，玫瑰花鞣質的提取率不斷升高。壓力的影響主要體現在改變超臨界CO2的密度和極性。在相同的溫度和夾帶劑用量下，加壓可以增加CO2的密度，減少分子間的傳質阻力，增加溶質與溶劑之間的傳質效率，從而有利于目標組分的萃取。但另一方面，壓力的增加會增加設備費用，因此萃取壓力不宜過高，且由于使用的超臨界CO2萃取儀器具有過壓保護，壓力不能超過35 MPa。

2.6 夾帶劑流量對玫瑰花鞣質提取率的影響

夾帶劑流量對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖6。

圖6 夾帶劑流量對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.6 Extraction effect of tannin from rose by entrainer fluence

由圖6 可知，通過夾帶劑泵加入的乙醇流速增大時，玫瑰花鞣質的萃出速率有所提高；但當乙醇流速低時，由于與玫瑰粉末接觸時間相對延長，則有利于玫瑰鞣質總量的提高。

2.7 夾帶劑用量對玫瑰花鞣質提取率的影響

夾帶劑用量對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖7。

圖7 夾帶劑用量對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.7 Extraction effect of tannin from rose by entrainer dosage

由圖7 可知，隨著夾帶劑乙醇用量的增加，玫瑰花鞣質的提取率急劇上升。但在900 mL 以后玫瑰鞣質提取率的上升趨勢減緩。對于鞣質這類強極性物質，夾帶劑用量的多少對改善玫瑰花鞣質在超臨界CO2中的溶解性能具有決定性的影響。另一方面，當夾帶劑量過高時，將會延長萃取時間及增加操作成本，因此乙醇相對玫瑰粉用量在3 mL/g 為適宜。

2.8 分離溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響

分離溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響見圖8。

圖8 分離溫度對玫瑰花鞣質提取率的影響Fig.8 Extraction effect of tannin from rose by separation temperature

由圖8 可知，超臨界CO2流體在分離柱中降壓降溫后成為常壓氣體，這時鞣質從流體中析出，當分離溫度小于40 ℃時，隨著分離溫度的升高，鞣質的析出逐漸增多，超過40 ℃后，上升趨勢不明顯，且超過50 ℃后，鞣質的析出還略有下降趨勢，可能是因為分離溫度過高，超臨界流體有部分未能成為常壓氣體而造成鞣質的析出減少。由此可知，分離溫度對鞣質的提取率影響不大，考慮溫度升高需耗費能源較多，所以分離溫度選用40 ℃。

2.9 超臨界CO2 萃取玫瑰花鞣質正交試驗結果分析

超臨界CO2萃取法L（934）正交試驗設計及結果見表3。

表3 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗設計及結果Table 3 The results of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

續表3 超臨界CO2 萃取法L9（34）正交試驗設計及結果Continue table 3 The results of the L9（34）supercritical CO2 extraction experiment

由表3 正交試驗結果直觀分析可知，萃取壓力對玫瑰花鞣質的提取率影響最大，而萃取溫度、萃取時間、夾帶劑乙醇濃度對玫瑰花鞣質的提取率影響稍小，為了確定各因素對提取效果的影響及其顯著性，進行方差分析，見表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

由表4 方差分析結果分析，各因素對提取率的影響大小依次為：萃取壓力＞萃取時間＞夾帶劑濃度＞萃取溫度，最優提取條件為：萃取壓力30 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時間60 min、夾帶劑乙醇濃度50%。驗證試驗結果見表5。

表5 驗證試驗Table 5 The textual research

由表5 驗證試驗結果最終確定超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質的最優提取條件為：玫瑰花粉粒度40 目、萃取壓力 30 MPa、萃取溫度 60 ℃、萃取時間60 min、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa、夾帶劑乙醇濃度50%、流速15 mL/min、乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質的提取率為44.84 mg/g。

3 討論

超臨界CO2萃取玫瑰花中鞣質的試驗分別用丙酮、乙醇、甲醇、水做夾帶劑，增強超臨界流體的極性[19]，以提高鞣質的提取率，用丙酮、乙醇和甲醇做夾帶劑，鞣質的提取率基本相同，只有水偏低。本文研究所提取的玫瑰花中的活性成分主要用于食品與保健品工業，必須達到綠色食品要求，因此考慮到溶劑的安全性、有效性、生產成本及操作上的后續工作等因素，本試驗選用乙醇作為超臨界CO2萃取的夾帶劑，既保證了玫瑰花鞣質的順利溶出，也便于后續工作特別是產品的應用生產。試驗采用玫瑰花粉末作為提取原料，當原料粒度過細時，不利于超臨界CO2流體從原料中通過，還可能造成原料堵塞萃取釜的過濾板，使流體進入分離柱的量大大減少，使玫瑰花鞣質的提取率降低[20]。在試驗中還發現，原料目數太高，對儀器的損害很大，減壓時會造成過濾板因內外壓強不同而破裂，原料漏出，清理儀器時很困難，所以，找到最適合的原料粉粹粒度對超臨界CO2萃取的提取率也有著較大影響。

4 結論

超臨界CO2萃取法提取玫瑰花中鞣質的最優提取工藝為：玫瑰花粉粒度40 目、萃取壓力30 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時間60 min、分離溫度40 ℃、分離壓力8 MPa、夾帶劑乙醇濃度50%、流速15 mL/min、乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質的提取率為44.84 mg/g。