響應面優化紫果西番蓮多糖提取工藝及抗氧化活性研究

賀銀菊，楊再波，彭莘媚，楊艷，張旋俊

（1.黔南民族師范學院化學化工學院，貴州都勻558000；2.貴州省高校民族藥用植物資源開發工程研究中心，貴州都勻558000）

西番蓮又稱巴西果、熱情果、雞蛋果，是西番蓮科多年木質藤本植物果實的通稱，氣味芳香濃郁，被稱為“果汁之王”[1]。目前西番蓮主要有黃果、紫果、紫紅色果三個品種，其果實均由果皮和果肉兩部分組成，其果肉呈黃色、味酸，含有豐富的礦物質元素、蛋白質、胡蘿卜素、A 族B 族維生素、有機酸、維生素C、人體所需要的氨基酸和多糖[2-3]。多糖是一類高分子化合物，具有免疫調節[4]、抗癌[5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]、降血糖[10]等多種藥理活性。常用的提取多糖的方法是水提法[11]和堿提法[12]，但這兩種方法提取率低、損失大，近年來微波法[13]、酶法[14]和超聲輔助法[15]等提取方法的應用越來越多，其提取效果優于水提法和堿提法。超聲輔助提取是指在聲波產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用下，破壞植物藥材的細胞，使溶劑滲透到研究對象細胞，縮短超聲時間，提高提取率，且提取工藝運行成本低，操作簡單易行。本文以紫果西番蓮為研究對象，以蒸餾水為提取劑，采用單因素試驗和響應面優化試驗優化紫果西番蓮果肉多糖的提取工藝，并采用苯酚-硫酸法測定紫果西番蓮果肉多糖提取量，并以清除DPPH 自由基和·OH 能力評價紫果西番蓮果肉多糖的抗氧化活性，以期為紫果西番蓮的價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫果西番蓮：2018 年11 月采于貴州省平塘縣塘邊鎮新街村，成熟后采摘，去皮取其果肉備用。葡萄糖標準品：中國食品藥品檢定研究院；苯酚、硫酸（分析純）：西安化玻試劑有限公司。DPPH、鄰二氮菲：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.2 儀器設備

DZ-2A 型真空干燥箱、SHZ-D 循環水真空泵：鄭州英峪予華儀器有限公司；TP-A200 電子天平：上海諾萱科學儀器有限公司；BS1105 電子天平：北賽多利斯天平有限公司；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901 型雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精確稱取烘干至恒重的葡萄糖10.0 mg，加蒸餾水溶解后轉入100 mL 容量瓶定容，得0.1 mg/mL 葡萄糖標準液備用。分別取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的葡萄糖標準液于5 支具塞試管中，加水補足至1.0 mL 后搖勻，得濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖標準液。在5 支具塞試管中加入1.0 mL 質量濃度為5%的苯酚，再在冰水浴條件下加入5.0 mL 的濃硫酸混勻，沸水浴加熱30 min 后冷卻至室溫，在樣品和標準品的最佳吸收波長488 nm 處測定吸光度值。以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 樣品溶液多糖測定

稱取5.00 g 備好的紫果西番蓮果肉于250 mL 錐形瓶中，以蒸餾水為提取劑，按照單因素試驗條件、響應面分析試驗因素和水平進行試驗，提取完成后抽濾，濾液轉入50 mL 容量瓶后蒸餾水定容到刻度，即得樣品溶液。用蒸餾水將樣品溶液稀釋100 倍后即得待測液，取1 mL 待測液的溶液于具塞試管中，按照1.3.1的方法測定其多糖提取量。

式中：C 為稀釋后提取液多糖的濃度，μg/mL；V 為樣品溶液的體積，mL；N 為總稀釋倍數；m 為稱取的紫果西番蓮果肉的質量，g。

1.3.3 紫果西番蓮果肉多糖提取單因素試驗

按照1.3.2 中樣品溶液的方法，將試驗基本條件定為：液料比4 mL/g，超聲時間15 min，超聲功率300 W和超聲溫度 60 ℃，以液料比（2、3、4、5、6 mL/g）、超聲時間（5、10、15、20、25 min）、超聲功率（200、250、300、350、400 W）和超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）為單因素試驗條件。改變其中一個試驗條件分別考察液料比、超聲時間、超聲功率和超聲溫度對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響，按照1.3.2 的方法測定多糖提取量。

1.3.4 紫果西番蓮果肉多糖提取響應面優化設計試驗

根據單因素試驗的結果和Box-Benhnken 的中心組合設計響應面優化試驗，具體的試驗因素及水平見表1。根據響應面優化設計試驗結果進行驗證性試驗，并計算多糖提取量。

表1 響應面分析試驗因素和水平Table 1 Levels and factors of response surface methodology

1.3.5 紫果西番蓮果肉多糖抗氧化活性

1.3.5.1 多糖清除DPPH 自由基活性測定

按照文獻[16]測定多糖清除DPPH 自由基能力：將DPPH 樣品配制成濃度為2×10-4mol/L 的乙醇溶液，避光保存備用；配制不同濃度梯度的多糖樣品溶液備用。準確吸取2.0 mL DPPH 乙醇溶液和2.0 mL 不同濃度的樣品溶液于10 mL 比色管中，搖勻放置30 min，在517 nm 處測定其吸光度值為A1，按照同樣的方法測定2.0 mL 乙醇溶液和2.0 mL 不同濃度的樣品液的吸光度A2，2.0 mL 乙醇溶液和2.0 mL DPPH 溶液的吸光度A3。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

1.3.5.2 多糖清除·OH 活性測定

按照文獻[16]測定多糖清除·OH 能力：取1.5 mL 5 mmol/L 的鄰二氮菲溶液于10 mL 比色管中，加2.0 mL磷酸鹽緩沖液混勻，再加1.0 mL 7.5 mmol/L 的FeSO4溶液混勻，蒸餾水定容至刻度，在37 ℃的水浴保溫1 h，在510 nm 處測定吸光度得A0；取1.5 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液于10 mL 比色管中，加2.0 mL 磷酸鹽緩沖液混勻，再加7.5 mmol/L 的FeSO4溶液1.0 mL 混勻，加入1.0 mL 1.0 mL/L 的H2O2，蒸餾水定容至刻度，在37 ℃的水浴保溫1 h，在510 nm 處測定吸光度得A1；取1.5 mL 5 mmol/L 的鄰二氮菲溶液于10 mL 比色管中，加2.0 mL 磷酸鹽緩沖液混勻，再加1.0 mL 7.5 mmol/L 的FeSO4溶液混勻，分別加入0.1 mL 不同濃度的多糖樣品溶液，再加1.0 mL 1.0 mL/L 的H2O2，蒸餾水定容至刻度，37 ℃水浴保溫1 h，在510 nm 處測定吸光度（此為樣品吸光度）得A2。按下式計算·OH清除率：

2 結果與分析

2.1 標準曲線的線性關系

根據1.3.1 葡萄糖濃度和吸光度值，用Origin8.0軟件繪制標準曲線。結果如圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1 可知，葡萄糖標準品在 20.0 μg/mL ～100.0 μg/mL 范圍內吸光度A 與濃度呈良好的線性關系，回歸方程為：y=0.011 26x+0.169 32，R2=0.999 4。

2.2 單因素對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響

2.2.1 液料比對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響

液料比對果肉多糖提取量的影響見圖2。

圖2 液料比對紫果西番蓮果肉多糖提取量的影響Fig.2 Effect of solvent to material ratio on extraction of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖2 可見，液料比為5 mL/g 時多糖提取量最高；液料比低于5 mL/g 時，隨著液料比的增大，多糖提取量升高；液料比高于5 mL/g 時，隨著液料比的增大，多糖提取量降低，因此較優液料比為5 mL/g，選擇4、5、6 mL/g 作為響應面設計的3 個水平。

2.2.2 超聲時間對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響

超聲時間對果肉多糖提取量的影響見圖3。

圖3 超聲時間對紫果西番蓮果肉多糖提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖3 可見，超聲時間為20 min 時多糖提取量最高；超聲時間少于20 min 時，隨著超聲時間的增加，多糖提取量升高；超聲時間多于20 min 時，隨著超聲時間的增大，多糖提取量降低，因此較優超聲時間為20 min，選擇 15、20、25 min 作為響應面設計的 3 個水平。

2.2.3 超聲功率對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響

江蘇省作為國家綜合醫改試點省份之一，“兩票制”已從2017年12月31日起正式開始實施[2]。“兩票制”對于我省的藥品批發企業而言，是一個全新的政策要求，為應對新的措施，企業必然要調整經營策略，改變經營思路。“兩票制”的實施會給藥品流通行業格局帶來怎樣的影響？企業在執行過程中會面臨怎樣的機遇與挑戰、產生怎樣的困難與問題？本文將通過上述問題的探討，對藥品批發企業執行“兩票制”過程中遇到的問題及解決辦法進行研析，為企業順利應對政策變化、長期健康發展提供參考。

超聲功率對果肉多糖提取量的影響見圖4。

圖4 超聲功率對紫果西番蓮果肉多糖提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖4 可見，超聲功率為300 W 時多糖提取量最高，超聲功率低于300 W 時隨著超聲功率的增加，多糖提取量升高；超聲功率高于300 W 時隨著超聲功率的增大，多糖提取量降低，因此較優超聲功率為300 W，選擇250、300、350 W 作為響應面設計的3 個水平。

2.2.4 超聲溫度對紫果西番蓮果肉多糖提取的影響

超聲溫度對果肉多糖提取量的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對紫果西番蓮果肉多糖提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature rate of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖5 可見，超聲溫度為70 ℃時多糖提取量最高；超聲溫度低于70 ℃時，隨著超聲溫度的增加，多糖提取量升高；超聲溫度高于70 ℃時，隨著超聲溫度的增大，多糖提取量降低，因此較優超聲溫度為70 ℃，選擇65、70、75 ℃作為響應面設計的3 個水平。

2.3 響應面試驗優化

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據Box-Benhnken 的中心組合原理設計四因素三水平的29 組試驗，優化試驗數據見表2。

表2 響應面設計試驗結果Table 2 Arrangement and results of response surface methodology

用design-expert 8.0.6 進行分析與擬合后，得紫果西番蓮多糖提取量（Y）的回歸方程：

Y（mg/g）=97.72+1.16A-0.91B+7.59C-0.072D-0.35AB-0.95AC-0.71AD+1.71BC+0.82BD-0.49CD-4.93A2-0.99B2-7.07C2-2.83D2（其中 A、B、C、D 為 4 個因素的編碼）。

模型的方差分析見表3。

表3 模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in model

續表3 模型的方差分析Continue table 3 Analysis of variance in model

由表3 可見，模型的 F 值為 53.02，P 值小于 0.000 1，表明試驗二次模型可信度高，能正確反映各因素與響應值之間的變化關系。確定系數R2=0.981 5，校正確定系數=0.963 0，變異系數CV=1.37%較小，失擬項大于0.05（0.408 4），說明模型擬合好，穩定、可靠。A、C、A2、C2、D2對多糖提取量影響極顯著（P＜0.01），B 及交互項BC 對多糖提取量影響顯著（P＜0.05），因素D、B2及交互項 AB、AC、AD、BD、CD 對多糖提取量沒有顯著性影響（P＞0.05）。由因素 A、B、C、D 的 F 值（或者 P值）大小可以得出各因素對多糖提取量影響順序為C＞A＞B＞D。

兩兩因素交互作用響應面見圖6。

圖6 兩兩因素交互作用的響應面Fig.6 Response surface of the effect interaction between two factors

由圖6 可知，各因素相互作用對多糖提取量影響，即響應面對各因素的敏感程度，反映了在兩個因素固定的條件下，另外兩兩因素對多糖提取量影響，響應面坡面越陡峭，則多糖提取量受試驗因素影響就越大，反之響應面坡面越平緩，則多糖提取量受試驗因素影響就越小。兩兩因素交互響應面坡面陡峭順序為BC＞AC＞BD＞AD＞CD＞AB，即超聲時間和超聲功率交互作用響應面最陡峭，表明超聲時間和超聲功率的交互作用對多糖提取量影響最大，而液料比和超聲時間交互作用響應面最平緩，表明液料比和超聲時間的交互作用對多糖提取量影響最小。

2.3.2 響應面試驗優化及驗證試驗

通過design-expert 8.0.6 軟件，根據回歸模型預測紫果西番蓮果肉多糖最佳提取工藝為：液料比5.07 mL/g、超聲時間 19.75 min、超聲功率 326.44 W 和超聲溫度69.63 ℃此時多糖理論提取量為99.7966 mg/g。根據預測條件和實際操作設計多糖提取條件為：液料比5 mL/g、超聲時間20 min、超聲功率330 W 和超聲溫度70 ℃，按此工藝進行平行試驗，測得紫果西番蓮果肉的平均多糖提取量為98.82 mg/g。實測結果和預測結果接近，表明模型擬合良好，參數準確可靠。

2.4 紫果西番蓮果肉多糖抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH 自由基活性

紫果西番蓮果肉多糖對DPPH 自由基的清除活性如圖7 所示。

圖7 紫果西番蓮果肉多糖對DPPH 自由基的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖7 可知，紫果西番蓮果肉多糖對DPPH 自由基具有較強的清除能力。濃度從20 μg/mL 升高到120 μg/mL 時，其多糖清除活性隨著濃度的升高而增強，當質量濃度超過120 μg/mL，其多糖對DPPH 自由基的清除率趨于平緩，其清除活性在82%附近波動，經線性擬合，紫果西番蓮果肉多糖對DPPH 自由基的IC50值為 66.97 μg/mL。

2.4.2 清除·OH 活性

紫果西番蓮果肉多糖對·OH 的清除活性如圖8所示。

圖8 紫果西番蓮果肉多糖對·OH 的清除作用Fig.8 Hydroxyl radicals scavenging capacity of polysaccharides from the purple passionfruit

由圖8 可知：紫果西番蓮果肉多糖對·OH 具有較強的清除能力。濃度從0.1 mg/mL 升高0.5 mg/mL 范圍時，其多糖清除活性隨著濃度的升高而增強，當質量濃度超過0.5 mg/mL，其多糖對·OH 的清除率趨于平緩，其清除活性在86%附近波動，經線性擬合，紫果西番蓮果肉多糖對·OH 的IC50值為0.23 mg/mL。

3 結論

通過最大吸收波長掃描確定多糖的檢測波長為488 nm，響應面分析試驗結果表明：二次模型是極顯著的，準確性較高。4 個因素對多糖提取量影響順序為C＞A＞B＞D，即超聲功率對多糖提取量影響最大，其次是液料比的影響，再次是超聲時間的影響，超聲溫度對多糖提取量的影響最小。根據回歸模型進行預測和驗證性試驗，建立了紫果西番蓮果肉中多糖提取的最佳工藝：液料比5 mL/g、超聲時間20 min、超聲功率330 W 和超聲溫度70 ℃，紫果西番蓮果肉多糖的平均提取量為98.82 mg/g。抗氧化活性表明紫果西番蓮果肉多糖對DPPH 自由基和·OH 均有一定的清除能力，其清除DPPH 自由基、·OH 的半抑制濃度（IC50）別為66.97μg/mL 和 0.23 mg/mL。