東北刺人參的抗氧化作用研究

王艷艷，翟春梅，懷雪，孟永海，申柯欣，李廷利，黃莉莉

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

刺人參為五加科刺人參屬刺人參（Oplopanax elatus Nakai.）的干燥根及根莖，也稱刺參或東北刺人參，有補氣助陽、強心利尿的功效，主要分布于我國的吉林省長白山地區，以及俄羅斯遠東山區和朝鮮北部山區[1]。在韓國，東北刺人參被認為具有與人參類似的適應原樣作用，主要用于治療慢性疲勞綜合癥、神經衰弱、精神分裂癥、心血管疾病等，蘇聯早在20 世紀50年代就將其正式批準作為補品和抗糖尿病藥物用于臨床[2-4]。東北刺人參主要含有皂苷、蒽醌、脂肪酸、黃酮、氨基酸、揮發油等化學成分。現代藥理學研究表明，東北刺人參具有抗菌、抗炎、抗衰老、抗驚厥、抗疲勞、解熱、改善睡眠、調節血壓、改善生殖功能和降糖等多方面的生物活性。目前，國內對東北刺人參不定根抗氧化能力研究已有文獻報道[5]，而野生東北刺人參藥材的抗氧化活性研究較少。本文對產于吉林長白山的東北刺人參水煎液的抗氧化和抗衰老作用進行考察，為人工栽培品的藥效質量的研究提供理論依據，同時，也為更好的保護和利用刺人參的野生資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

野生型Canton S 品系黑腹果蠅，由中國科學院上海生命科學院果蠅技術平臺提供。ICR 小鼠，雌雄各半，體重（20±2）g，SPF 級，均由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供，許可證號：SCXK（黑）2013-004。

1.2 試驗藥物

東北刺人參產自吉林省集安市野生藥材種植基地，秋季采收，將其根及根莖，洗凈，切段曬干備用。經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為東北刺人參的根及根莖。

東北刺人參根及根莖凍干粉由黑龍江中醫藥大學中藥藥理實驗室自制：稱取一定量的野生東北刺人參藥材，用10 倍量的蒸餾水浸泡2 h，加熱回流提取2 次，每次1.5 h，合并提取液，濾過濃縮得東北刺人參水煎液，凍干，待用。

1.3 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine，DPPH）：上海梯希愛化成工業發展有限公司；蔗糖（批號20180103）：天津市濱海科迪化學試劑有限公司；瓊脂細菌學級（批號1182GR500）：Oxoid L.td.Wade Road.Basingstoke.Hants；丙酸（批號20160327）：天津市福晨化學試劑廠；酵母粉（批號LP0021）：英國OXOID 公司。考馬斯亮藍測試盒（批號20180514）、丙二醛測試盒（MAD，批號20180710）、超氧化物歧化酶測試盒（SOD，批號20180709）：南京建成成生物工程研究所。

1.4 儀器

CT15RE 高速冷凍離心機：日本HITACHI 公司；AL 204 電子天平：美國 METTLER TOLEDO 公司；SynergyMX 酶標儀：美國 BIOTEK 公司；EYELA 冷凍干燥機：上海愛郎儀器有限公司；FJ-200 高速萬能粉碎機：上海申勝儀器公司；HH.WZ.CY600 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備公司。

1.5 實驗環境

將實驗動物置于獨立通氣籠中（噪音≤55dB（A），換氣次數：20 次/h～50 次/h，潔凈度：100 級，壓差≥10 Pa，菌落數≤1 個/皿時）飼養；外界溫度（24±2）℃，濕度（55±15）%，光照強度：300 lux，12 h/12 h 明暗交替（7：00-19：00 光照；19：00～次日 7：00 黑暗）。

1.6 方法

1.6.1 微板法檢測DPPH 自由基方法的建立

1.6.1.1 DPPH 溶液制備

取16 mg DPPH 試劑，精密稱定，至10 mL 容量瓶，用無水乙醇為溶劑溶解并定容，搖勻，得到DPPH儲備液的濃度為1.6 mg/mL，DPPH 儲備液在4 ℃冰箱避光冷藏。

1.6.1.2 DPPH 標準曲線的制備

取DPPH 儲備液，稀釋成以下系列濃度：1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL，搖勻，在波長 517 nm 下測定吸光度值，以吸光度（A）為縱坐標，DPPH 濃度為橫坐，標繪制標準曲線。

1.6.1.3 DPPH 法實驗參數的優化

1）不同反應溫度的考察

參照 Brand-WilliamsW 和 Zim mer AR[6-7]建立的DPPH 自由基清除實驗稍作改進，即DPPH 溶液與樣品溶液按體積比 1 ∶1 加入 96 孔板，振搖 30 s，分別考察避光反應時間分別為 15、30、45 min 后，于 517 nm 處測定的吸光度（OD 值）。其中DPPH 溶液中加入樣品溶液的吸光度為 A1（100 μL DPPH 溶液+100 μL 樣品溶液）；樣品溶液吸光度為A2（100 μL 無水乙醇+100 μL樣品溶液），DPPH 溶液加入空白溶劑的吸光度為A3（100 μL DPPH 溶液+100 μL 無水乙醇）。根據公式計算DPPH 清除率（%）。樣品溶液清除DPPH 自由基減少吸光度為 A3-（A1-A2）[8-9]。DPPH 清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100%。

2）不同反應體系的考察

在反應時間確定的基礎上，考察了DPPH 溶液與樣品溶液按不同反應體積體系配比（3 ∶2，2 ∶1，1 ∶1），對DPPH 自由基清除率（%）的影響，其它步驟同1.6.1.3中1）的方法。

1.6.1.4 東北刺人參的抗氧化作用

精確稱量刺人參凍干粉0.5 g，溶劑定容于25 mL容量瓶，搖勻，并稀釋為不同的濃度梯度（0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL），以維生素 C（VC）為陽性對照藥，按照“1.6.1.3”中1）的優化方法測定各組吸光度值，計算DPPH 自由基清除率，并把清除率對濃度作非線性回歸擬合，得到兩者的量效關系，求出當清除率為50 %時對應的濃度，從而得出各自的IC50值[8]。

1.6.2 東北刺人參對果蠅壽命的影響

果蠅培養基的制備采用基礎培養基配方，主要由蒸餾水69 mL，玉米粉 6.3 g，蔗糖 4.65 g，瓊脂 0.45 g，酵母粉0.45 g，丙酸0.45 mL 組成，在該培養基配制過程中添加 0.374、0.187、0.098、0.049 g 的刺人參提取物凍干粉，分別折合藥物質量濃度為0.46 %、0.23 %、0.12%、0.06%，對照組則給予正常培養基飼養。參照文獻方法加以改進[10-12]對果蠅行為學考察如下。

1.6.2.1 壽命實驗

收集12 h 內羽化成蟲的果蠅，隨機分為對照組和給藥組，每組雌雄各 100 只，在（25±4）℃、相對濕度為（60±10）%、光/暗時間為 12 h/12 h 的恒溫恒濕智能培養室中培養。每4 天更換一次培養基并觀察記錄果蠅的情況。計算平均壽命、中間壽命、最高壽命。

1.6.2.2 亞急性氧化損傷實驗

取30 日齡果蠅，每組雌雄各100 只，分別給予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4 小時記錄一次，直至果蠅全部死亡。

1.6.2.3 衰老果蠅的攀爬實驗

收集12 h 內羽化成蟲的果蠅，每組10 只果蠅，雌雄各半。于第 0、10、20、30 天移入空的果蠅管中，觀察10 s 內攀爬超過8 cm 處的果蠅只數。每組重復實驗 5 次。

1.6.2.4 生殖實驗

分別取7、15、30 天果蠅，每管雌雄各一只，飼養3天后取出，記錄第一天出生的子代蠅個數，連續記錄7天，每組實驗平行6 次。

1.6.3 刺人參對力竭游泳實驗小鼠MDA 含量和SOD活力的影響

選取ICR 小鼠，置于實驗環境中適應一周。隨機分為5 組，每組12 只，分別為空白對照組，東北刺人參凍干粉高、中、低劑量組。高、中、低劑量組分別按500、250、125 mg/kg 劑量灌胃給藥，空白組動物給予生理鹽水溶液，給藥容積為0.2 mL/10 g 體重，連續給藥15天，小鼠末次給藥30 min 后，不負重游泳90 min，頸椎脫臼處死，解剖取出肝臟，生理鹽水洗去血液，制成10%肝勻漿。參照丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒說明書操作測定MDA 含量和SOD 活力。

1.7 統計學處理

計量資料的統計采用SPSS 17.0 軟件進行方差分析（Analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數據以D 表示，組間做t 檢驗，P<0.05 則表示有顯著性差異，有統計學意義，P<0.01 為極顯著性差異。

2 結果

2.1 東北刺人參清除DPPH 自由基的能力

2.1.1 DPPH 標準曲線的制備

DPPH 儲備液稀釋后檢測各濃度的吸光度值，以吸光度（A）為縱坐標，DPPH 濃度為橫坐標繪制標準曲線，線性方程為y=1.023 7x-0.143 4，R2=0.999 4。結果表明 DPPH 在 0.062 5 mg/mL～0.5 mg/L 濃度范圍內，吸光度與濃度范圍具有良好的線性關系。

2.1.2 微板法實驗參數的優化結果

以刺人參凍干粉為考察對象，供試品溶液濃度為7.5 mg/mL，根據不同反應時間與反應體積比之間的關系設定的參數優化的結果見表1。

表1 不同反應時間和反應體積比的樣本清除率Table 1 Sample clearance rate for different reaction times and reaction volume ratios

表1 結果表明，微板法測定DPPH 自由基參數，最佳反應時間為30 min，反應體積為1 ∶1。

2.1.3 東北刺人參的抗氧化作用

東北刺人參的抗氧化作用見表2。

刺人參水煎液凍干粉在0.625 mg/mL～10.0 mg/mL的濃度范圍內，自由基清除率為42.2%～89.0%。陽性對照藥 VC在 0.062 5 mg/mL～1.00 mg/mL 的濃度范圍內，自由基清除率為54.8%～97.4%。根據以上實驗結果計算IC50值，陽性對照VC為0.040 1 mg/mL，刺人參為0.829 mg/mL。

2.2 東北刺人參對果蠅壽命相關行為學指標考察結果

2.2.1 東北刺人參對果蠅壽命的影響

東北刺人參對果蠅壽命的影響見表3。

表2 東北刺人參的抗氧化作用（D）Table 2 Antioxidant effect of CRS supplement（D）

表2 東北刺人參的抗氧化作用（D）Table 2 Antioxidant effect of CRS supplement（D）

組別DPPH 自由基清除率/%1 0.625 42.2±2.04 0.0625 54.8±1.33 2 1.250 57.6±1.02 0.125 76.2±1.60 3 2.50 82.6±0.49 0.250 96.0±0.63 4 5.00 86.0±0.63 0.500 96.8±1.60 5 7.50 87.2±0.98 0.750 97.2±1.33 6 10.00 89.0±2.28 1.000 97.4±1.50東北刺人參 VC濃度/（mg/mL）DPPH 自由基清除率/%濃度/（mg/mL）

表3 東北刺人參對果蠅壽命的影響（n=100，D）Table 3 Lifespan parameters in drosophila following CRS supplement（n=100，D）

表3 東北刺人參對果蠅壽命的影響（n=100，D）Table 3 Lifespan parameters in drosophila following CRS supplement（n=100，D）

注：*P<0.05 與對照組相比差異顯著，**P<0.01 與對照組相比差異極顯著。

組別 性別/數量 平均壽命/d 最長壽命/d對照組 ♀n=82 40.40±13.01 61.20±1.92♂n=70 39.37±13.72 61.20±1.93刺人參 1 組（0.46 %） ♀n=93 40.65±14.33 64.80±2.53**♂n=82 45.22±13.72** 66.80±1.93**刺人參 2 組（0.23 %） ♀n=100 43.40±14.01 64.80±3.15**♂n=97 42.70±15.18 66.80±1.93**刺人參 3 組（0.12 %） ♀n=88 43.57±13.30* 65.20±3.29**♂n=67 40.63±13.30 62.40±2.06刺人參 4 組（0.06 %） ♀n=85 41.03±13.15 64.40±2.95*♂n=85 40.37±12.40 63.60±3.98*

在果蠅壽命實驗中，與空白對照組相比，各給藥組的果蠅平均壽命和最長壽命，均有不同程度的延長，其中，雌雄果蠅在藥物濃度為0.46%和0.23%時最長壽命均呈現極顯著差異（P<0.01），雌果蠅在藥物濃度為0.12 %時最長壽命亦呈現極顯著差異（P<0.01），藥物濃度為0.06%的雌雄果蠅的最長壽命呈現顯著差異（P<0.05）。

2.2.2 東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷實驗

東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷實驗見表4。

表4 東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100，D）Table 4 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following CRS（n=100，D）

表4 東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100，D）Table 4 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following CRS（n=100，D）

平均存活率延長/%對照組 ♀n=82 31.80±9.49 -♂n=70 32.28±11.21 -刺人參 1 組（0.46%） ♀n=74 37.89±9.32** 19.15♂n=97 36.57±12.27** 13.29組別 性別/數量 平均存活時間/h

續表4 東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100，D）Continue table 4 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following CRS（n=100，D）

續表4 東北刺人參對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100，D）Continue table 4 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following CRS（n=100，D）

注：**P<0.01 與對照組相比差異極顯著；-表示無數值。

平均存活率延長/%刺人參 2 組（0.23%） ♀n=74 39.67±9.86** 24.75♂n=78 37.17±10.86** 15.15刺人參 3 組（0.12%） ♀n=74 33.36±9.87 4.90♂n=82 39.60±5.98** 22.67刺人參 4 組（0.06%） ♀n=81 34.27±12.14 7.77♂n=67 32.71±10.89 1.33組別 性別/數量 平均存活時間/h

在亞急性氧化損傷實驗中，與空白對照組比較，在藥物濃度為0.46%和0.23%時雌雄果蠅平均存活時間分別呈現極顯著差異（P<0.01），藥物濃度為的0.12 %的雄果蠅平均存活時間亦呈現極顯著性差異（P<0.01）。

2.2.3 東北刺人參對不同時期果蠅的攀爬活動的影響

東北刺人參對不同時期果蠅的攀爬活動的影響見表5。

表5 東北刺人參對不同時期果蠅的攀爬活動的影響（n=5，D）Table 5 Climbing ability in drosophila following CRS supplement（n=5，D）

表5 東北刺人參對不同時期果蠅的攀爬活動的影響（n=5，D）Table 5 Climbing ability in drosophila following CRS supplement（n=5，D）

注：*P<0.05 與對照組相比差異顯著。

組別 攀爬能力/只10 d 20 d 30 d對照組 ♀ 4.80±0.84 4.20±0.84 3.40±0.89♂ 4.80±0.33 4.40±0.33 2.80±0.84刺人參 1 組（0.46 %） ♀ 4.80±0.71 5.20±0.54 3.40±0.89♂ 4.80±1.30 6.00±0.71* 3.40±1.14刺人參 2 組（0.23 %） ♀ 4.60±0.54 4.80±0.84 2.80±0.84♂ 4.90±0.54 5.80±0.84* 2.80±0.84刺人參3 組（0.12 %） ♀ 4.80±1.92 4.20±0.83 2.40±0.55♂ 4.60±1.14 4.40±1.14 2.80±1.00刺人參4 組（0.06 %） ♀ 5.00±1.58 5.00±0.71 3.20±0.84♂ 4.60±1.14 4.20±0.45 2.40±0.89

由表5 可知，與空白對照組相比，東北刺人參給藥濃度為0.46%和0.23%的雄果蠅攀爬能力在第20 天顯著增加（P<0.05）；其余各組無顯著性差異。

2.2.4 東北刺人參對果蠅繁殖能力的影響

東北刺人參對果蠅繁殖能力的影響見表6。

與空白對照組相比，給藥后各組7 日和15 日蠅的子代數均呈不同程度增加，其中，給藥濃度為0.46%組7 日齡果蠅的子代數增加有極顯著意義（P<0.01）；給藥濃度為0.23%組7 日齡果蠅的子代數增加有極顯著意義（P＜0.01）；給藥各組15 日齡果蠅的子代數增加均有顯著性差異（P＜0.05）；給藥濃度0.46%和0.23%組的30 天蠅的子代數增加有顯著差異（P＜0.05）。

表6 東北刺人參對果蠅繁殖能力的影響（n=6，D）Table 6 Reproduction parameters in Drosophila following CRS supplement（n=6，D）

表6 東北刺人參對果蠅繁殖能力的影響（n=6，D）Table 6 Reproduction parameters in Drosophila following CRS supplement（n=6，D）

注：*P＜0.05 與對照組相比差異顯著，**P＜0.01 與對照組相比差異極顯著。

組別 繁殖能力/只7 d 15 d 30 d對照組 25.33±6.47 25.17±6.31 23.50±6.30刺人參 1 組（0.46 %） 53.17±9.37** 38.50±4.93* 33.83±2.92*刺人參 2 組（0.23 %） 41.67±8.09** 37.67±10.76* 33.50±7.74*刺人參 3 組（0.12 %） 37.83±5.11* 35.33±4.27* 29.50±9.89刺人參 4 組（0.06 %） 36.83±5.04 36.67±10.57* 28.33±5.56

2.3 刺人參對力竭游泳實驗小鼠SOD含量和MDA活力的影響

刺人參對力竭游泳實驗小鼠SOD 含量和MDA 活力的影響見表7。

表7 刺人參對小鼠SOD 和MDA 含量的影響（D）Table 7 Effects of Oplopanax elatus on MDA and SOD of mice（D）

表7 刺人參對小鼠SOD 和MDA 含量的影響（D）Table 7 Effects of Oplopanax elatus on MDA and SOD of mice（D）

注：#P＜0.05 與對照組相比差異顯著；##P＜0.01 與對照組相比差異極顯著；*P＜0.05 與對照組相比差異顯著。

組別SOD/（U/mg）MDA/（nmol/mg）對照組 417.13±29.23 12.45±0.22刺人參高劑量組 502.76±12.84* 7.61±0.15##刺人參中劑量組 461.96±10.74 9.12±0.93#刺人參低劑量組 437.08±18.81 10.60±1.51

由表7 可知，與空白對照組相比，刺人參凍干粉高劑量組MDA 含量降低具有顯著差異（P＜0.01），中劑量組具有統計學意義（P＜0.05）。同理，與空白對照組相比，刺人參凍干粉高劑量組SOD 活性升高有統計學意義（P＜0.05），上述結果提示東北刺人參能清除在有氧條件下產生的超氧自由基，以阻止自由基被破壞，抑制過氧化物產生，具有抗氧化的作用。

3 結論

研究發現，活性氧自由基產生過多，可導致生物膜中的多種不飽和脂類發生超氧化，形成脂質過氧化物，從而引起細胞結構和功能破壞。氧化損傷不僅與多種疾病的發生有著密切相關，還會造成細胞變形、突變和死亡，是人類衰老的重要原因之一[13]。天然抗氧化劑因在疾病預防與治療、延緩衰老過程中發揮重要作用而廣為人知，欲驗證這些天然抗氧化劑的生物活性，需采用體內外多種實驗方法。本實驗首先優化微板法測定DPPH 自由基清除率的條件，確定最佳反應時間為30 min，反應體積為1 ∶1，刺人參水煎液DPPH自由基清除率的IC50值為0.829 mg/mL，體外實驗結果顯示，刺人參具有顯著的抗氧化活性。國內外研究發現[1，14]，東北刺人參中主要含揮發油、皂苷、蒽醌、黃酮、脂肪酸、游離氨基酸等多種成分，其中酚類、多糖和皂苷類成分可能為抗氧化作用的有效成分。

果蠅作為一種真核多細胞生物，因其壽命短、繁殖力強，且其代謝、生理狀況和生長發育等也同哺乳動物基本相似，是研究抗氧化及抗衰老藥物的理想模型[15-16]。本實驗選取果蠅為實驗對象，分別考察不同濃度的東北刺人參對果蠅壽命相關行為學指標的影響。在考察壽命實驗中，各給藥組的果蠅平均壽命和最長壽命均有不同程度的延長，上述結果表明，長期服用東北刺人參具有延長壽命的作用，而此作用并未體現劑量依賴性。在繁殖能力實驗中，給藥后各組對果蠅的子代數均呈不同程度增加，由結果可知，東北刺人參具有改善果蠅生殖能力的作用，且呈現計量依賴性，而隨著日齡增加果蠅子代數增加呈降低趨勢，提示適量補充東北刺人參可提高果蠅的繁殖能力。已有文獻報道[17-18]，東北刺人參對糖代謝紊亂所致的小鼠亞急性衰老模型癥狀有逆轉作用，與人參呈現相似的抗衰老作用。在體外抗氧化實驗中，刺人參水煎液凍干粉在0.625 mg/mL～10.0 mg/mL 的濃度范圍內，自由基清除率為42.2%～89.0%，生物活性和濃度成正相關，在體內亞急性氧化損傷實驗中，不同濃度東北刺人參雌雄果蠅平均存活時間不同程度延長，此外，該藥可降低力竭游泳實驗小鼠MDA 含量，提高SOD 活力。因此，東北刺人參不僅在體外有一定的抗氧化作用，而且在動物體內也有顯著的抗亞急性氧化損傷效果。

綜上所述，東北刺人參可延長果蠅壽命，增加果蠅的子代數量，提高老年蠅的攀爬能力，提高老齡果蠅抗亞急性氧化損傷能力，并降低力竭游泳實驗小鼠MDA 含量，提高SOD 活力，具有體內外抗氧化作用，并可改善果蠅與壽命相關的指標，上述研究結果可為東北刺人參的開發利用提供參考。