養血補腎方對形覺剝奪性高度近視模型鞏膜超微結構的影響

馬小兵 ，高君 ，亢澤峰 ，吳寧玲 ，邢凱 ，莊曾淵 ，楊劍英

高度近視眼是當今主要致盲性眼病之一［1-2］，鞏膜在決定眼球的大小和形狀并在影響眼球的屈光狀態中發揮著非常重要的作用。為探討鞏膜在近視的形成和發展的過程中超微結構的變化以及中藥對這種變化是否有干預作用，我們用形覺剝奪法建立豚鼠高度近視模型，并以養血補腎方進行干預治療，觀察治療后鞏膜的病理及超微結構變化，從而為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理

取2周齡大小的普通級三色健康豚鼠，40只，均為雄性，由北京科宇動物養殖中心提供，體重在180～250 g范圍之間，動物許可證號為SCXK （京）2012-0004。飼養1周后，進行檢影驗光及眼軸長度測量，用白色氣球制作半透明眼罩遮蓋右眼（R），建立形覺剝奪性近視 （Form Deprivation Myopia，FDM）模型，左眼（L）作為對照眼（未遮蓋眼）不做處理

正常喂養60 d后，再進行檢影驗光，以A超檢測眼軸長度，確定成功建立FDM模型。將實驗動物隨機分為治療組及對照組2組，每組20只，對照組不進行干預，治療組以養血補腎方12.7 g/kg灌胃（按照生藥量），2 ml／d灌胃給藥15 d后，測定相應指標。

1.2 主要藥物

養血補腎方：車前子15 g，枸杞子15 g，熟地黃15 g，覆盆子 15 g，五味子 15 g，丹參 12 g，當歸 12 g，菟絲子 15g，白芍 12g，川芎 12g，黃芪 20g，白術 12g，由中國中醫科學院眼科醫院中藥房提供。

1.3 方法

1.3.1 屈光度及眼軸檢測 （1）屈光度檢測：暗室中，1%復方托吡卡胺滴眼液散瞳后行檢影驗光，散光以半量等效球鏡計算屈光度（D）。（檢影驗光由同一位專業人員操作）。造模前后各檢查雙眼1次。（2）眼軸檢測：室內自然光下，結膜囊內滴0.4%鹽酸奧布卡因液麻醉后，通過眼科A/B超（SW-2100眼科A/B型超聲診斷儀，天津市索維電子科技有限公司）測雙眼眼軸長度，調整A超增益矯正儀器后，以手動模式連續測量3次，取平均值（眼軸測量由同一位專業人員操作）。造模前后各檢查雙眼1次。

1.3.2 光鏡檢查 2組于15 d后取眼球，標本置于眼球固定液中48 h以上，經各級酒精脫水，石蠟浸透包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。

1.3.3 電鏡檢查 取眼球后部眼球壁切成1mm×1mm大小組織塊，25 g/L戊二醛溶液中固定，10 g/L鋨酸固定,各級酒精及丙酮脫水,浸透包埋、固化，制成超薄切片(50～60 nm)，枸櫞酸鉛染色，JEM-1200EX 透射電鏡觀察、拍片。

1.4 統計學分析

采用SPSS17.0統計分析軟件對數據進行統計學分析處理。各組數據用均數±標準差(xˉ±s)表示，采用配對t檢驗對造模前后豚鼠屈光度及眼軸結果進行比較分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模2個月后各組眼軸及屈光狀態

實驗眼（右眼）呈明顯近視,與造模前的遠視狀態相比有－6.0 D以上的相對近視，而對照眼（左眼）為輕度遠視,差異有顯著性(P＜0.01)。各組實驗眼眼軸較對照眼延長明顯(P＜0.01)。（表1）

2.2 光鏡下觀察

鞏膜HE染色可見對照組對照眼（未遮蓋眼）顯示鞏膜膠原排列較為緊致。對照組模型眼鞏膜變薄，纖維變細，纖維間隙增寬，鞏膜膠原排列較稀疏，治療組模型眼顯示鞏膜膠原排列較為緊密，走行較規則（圖 1A-1C）。

表 1 豚鼠屈光度（D）和眼軸(mm)變化(xˉ±s)

2.3 電鏡下觀察

透射電鏡觀察結果顯示：對照組和治療組鞏膜膠原均為I型膠原。對照組模型眼鞏膜膠原纖維分布稀疏，鞏膜膠原纖維排列相對致密，纖維間空隙輕度增大。由對照組模型眼（圖2B）和對照組對照眼（圖2A）對比可見模型眼的膠原纖維直徑變小。對照組模型眼（圖2C）和對照組對照眼（圖2A）對比可見模型眼鞏膜膠原纖維間空隙輕度增大，而治療組模型眼鞏膜膠原纖維排列相對致密（2D）。對照組模型眼（圖2E）與對照眼（圖2F）比較：可見細胞外基質（圖中箭頭所示位置）明顯增多，內質網輕度擴張（圖2G）。

圖1 兩組后極部鞏膜視網膜HE染色觀察（×40）。1A 對照組對照眼（未遮蓋眼）；1B對照組模型眼（遮蓋眼）；1C治療組模型眼

圖2 后極部鞏膜膠原纖維橫斷面（白色珠狀）透射電鏡（TEM）觀察（×20000）。2A 對照組對照眼；2B對照組模型眼；2C對照組模型眼；2D 治療組模型眼；2E對照組模型眼，黑箭頭所指為細胞外基質；2F對照組對照眼，箭頭所指為細胞外基質；2G對照組模型眼，箭頭所指為粗面內質網

3 討論

鞏膜是近視發病及病理進展的靶器官，視網膜接受視覺刺激發出的信號分子通過脈絡膜最終作用于鞏膜，導致鞏膜重塑。有研究表明［3］：在近視模型眼中，鞏膜成纖維細胞生長受到抑制，表現為膠原纖維合成代謝減少，分解代謝增加，這些改變會引起膠原纖維的直徑變小，從而導致鞏膜變薄，眼軸變長，最終導致近視形成。本研究發現，高度近視模型眼的鞏膜明顯變薄，膠原纖維分布稀疏，直徑變小，排列紊亂，細胞外基質增多，而對照眼鞏膜膠原纖維排列緊密、分布均勻,細胞外基質少。這些超微結構的改變可能導致鞏膜抗壓能力減弱，易于延展。

Mcbrien 等［4］研究發現,形覺剝奪會導致鞏膜厚度變薄,膠原纖維直徑較正常直徑減小。另外一項研究發現：近視的發展過程中鞏膜膠原及蛋白多糖降解增加，合成減少，膠原纖維直徑變細［5］，這些超微結構的改變降低了鞏膜硬度，使眼軸易于延長而導致近視的形成。本研究發現高度近視模型眼的鞏膜膠原纖維直徑變小，分布稀疏，厚度明顯變薄。有學者報道,直徑較大的鞏膜膠原纖維數量可代表膠原的成熟度和抗拉伸能力[6]，近視眼鞏膜含有較多小直徑膠原纖維，對誘導近視形成的視覺刺激比較敏感，因此容易導致近視的發生及發展。此結果提示：阻止后鞏膜延伸、增強鞏膜抗力，對預防近視及阻止近視向高度近視發展具有重要意義。

目前鞏膜細胞外基質 （Extracellular matrix,ECM）與近視的關系日益受到重視。ECM具有許多重要的生理功能,如細胞的增殖、分化、遷移等過程,以及炎性病變、腫瘤浸潤、轉移等病理過程，在細胞間信號轉導過程中也發揮重要作用[7]。有研究發現：高度近視的主要病理改變為眼軸過度延長及鞏膜變薄,這些改變可能是鞏膜ECM主動重塑的結果，從而導致后極部鞏膜組織進行性變薄及丟失,眼軸不斷增長,最終導致視功能減退及相應并發癥發生[8]。本研究發現：高度近視模型眼的鞏膜明顯變薄，細胞外基質增多，而對照眼鞏膜膠原纖維平均直徑分布均勻,細胞外基質少。McBrien等［9］發現形覺剝奪可誘導鞏膜軟骨細胞增生，ECM增加,鞏膜重塑,導致眼軸延長,近視屈光度增加,研究結果與我們一致。

養血補腎方是莊曾淵研究員根據多年治療高度近視的臨床經驗總結而來。我們在臨床中發現高度近視的中醫證候主要為氣血兩虛，兼有肝腎虧虛，養血補腎方功在益氣活血、補腎明目，方中黃芪、白術健脾益氣，枸杞子、車前子、菟絲子、五味子、覆盆子補益肝腎明目，當歸、川芎、白芍、熟地黃、丹參養血活血。現代研究表明枸杞子具有改善微循環和抗氧化的作用[10]，另外枸杞子中玉米黃素和核黃素和對光感受器和神經節細胞有保護作用,這種作用可能是通過阻斷神經細胞凋亡作用實現的[11]。枸杞子中的玉米黃質還對視網膜有滋養作用，可以提高視敏度［12］。 丹參能有效提高血流速度［13］，改善視網膜及脈絡膜的供血[14]，其機制可能是通過降低血管內皮素的釋放，增加體內一氧化氮含量來調節血管的張力，從而改善血液循環[15]。本研究發現經過藥物治療后鞏膜的病理結構有所改善，提示養血補腎方能延緩鞏膜重塑變薄的病理改變，高度近視患者定期服用對延緩其進展有一定幫助。前期臨床研究表明高度近視眼視網膜存在血供不足及微循環障礙，養血補腎方可以改善高度近視患者的中央動脈的血流供應［16］，因此我們推測養血補腎方可能通過改善高度近視鞏膜的血供從而改善鞏膜超微結構。我們前期的研究還表明p-Stat3信號通路參與了實驗性近視的形成和發展，但養血補腎方對視網膜p-Stat3蛋白的表達變化并無影響［17］。

本研究觀察了高度近視模型眼鞏膜的病理及超微結構變化，以及養血補腎方對高度近視鞏膜的保護作用，為進一步防治高度近視的研究奠定了基礎，其發揮作用的機制有待進一步研究。