黃芪多糖對大黃魚頭腎巨噬細胞的免疫調節作用

孫林浩，程安怡，黃小紅，張偉妮,

(1.福建農林大學中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建 福州，350002；2.福建農林大學海洋研究院，福建 福州，350002)

大黃魚(Larimichthyscrocea)俗稱黃花魚，屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬(Larimichthys)，是我國獨特的海水魚種。目前，大黃魚養殖年產量十余萬噸，產值超百億元。然而，養殖規模的擴大和養殖環境的惡化造成了大面積疾病的爆發，給大黃魚養殖業造成了巨大的損失，已成為制約大黃魚養殖產業發展的主要瓶頸之一[1]。對于大黃魚養殖病害的防治，目前主要采用抗生素和化學藥物。但是抗生素和化學藥物的大量使用，造成了魚體藥物殘留、病原菌耐藥性增加及環境污染等嚴重問題。因此，尋找能有效防治水產動物疾病、替代或減少抗生素使用的免疫增強劑顯得非常必要。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效[2]。黃芪中含有多種活性成分，包括黃芪黃酮類、黃芪皂苷、黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide, APS)等。其中，黃芪多糖為黃芪中最主要的活性成分之一，在提高機體免疫力、抗腫瘤、降血糖等方面具有顯著效果[3]，現在多應用于中醫臨床和動物疾病的預防[4]。同時，APS在提高和改善水生動物免疫功能方面的作用也受到普遍關注。許明等(2008)發現在草魚飼料中添加適量的APS、維生素K3粉和維生素C，可提高草魚對病毒的抵抗力，達到治療草魚出血病的效果[5]。在飼料中添加1 200 mg/kg的APS可以顯著促進黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)各組織中的溶菌酶活力和吞噬細胞的吞噬能力，提高魚體對遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)的免疫保護力[6]，并顯著促進外周血白細胞的增殖[7]。

頭腎是硬骨魚類的主要免疫器官，也是主要造血器官，是免疫細胞的發生場所，在功能上類似于高等脊椎動物的脊髓[8-9]。頭腎中的巨噬細胞在識別與吞噬外來病原微生物、處理和呈遞抗原、激活淋巴細胞啟動特異性免疫應答等方面發揮了關鍵作用，其活性與功能是反映和評價魚類免疫水平的重要指標[10-11]。本研究以大黃魚頭腎巨噬細胞為研究對象，初步研究APS對大黃魚巨噬細胞呼吸爆發、吞噬活性及免疫相關細胞因子轉錄水平的影響，明確APS對大黃魚頭腎巨噬細胞的激活作用，有利于進一步研究APS對大黃魚頭腎巨噬細胞的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 大黃魚來自寧德海水養殖基地，體長(25±5)cm，體重(400±100)g。

1.1.2 主要試劑 黃芪切片購自北京同仁堂健康藥業有限公司；GIBCO Leibovitz′s L-15 無酚紅培養基、GIBCO胰酶、FITC-熒光微球購自Thermo公司；Percoll購于GE公司；丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、脂多糖(LPS)購于sigma公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒、DAF-FM DA(NO熒光探針)購自碧云天公司；紅細胞裂解液、反轉錄試劑盒購于天根公司；細胞總RNA提取試劑盒、Go Taq? qPCR Master Mix 購于Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芪多糖提取 采取水提醇沉法[12]從黃芪切片中制得粗糖。采用酶-Sevag法進一步去除蛋白。最后經AB-8大孔樹脂柱(柱體積為200 cm3)純化，將洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到純化的APS。用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量為78%。

1.2.2 大黃魚頭腎巨噬細胞的分離 大黃魚頭腎巨噬細胞的分離采取Percoll密度梯度離心技術，選取健康大黃魚，MS-222麻醉大黃魚至不動，隨后將其放置于解剖盤中，用75%的酒精擦拭魚體，殺死魚體表細菌。抽盡魚血，用剪刀和鑷子取出大黃魚頭腎。在超凈臺內研磨，研磨液過70 μm濾網，后將濾過液加入到事先配制好的體積分數分別為34%與51%的Percoll分離液液面之上。4 ℃、2 248 r/min離心30 min，得液面交界處細胞。加入紅細胞裂解液去除紅細胞，并用細胞計數儀計數。用細胞培養基稀釋后按每孔2 cm3加至6孔板中。每孔細胞濃度為2×106cells/cm3。貼壁2 h后，用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去懸浮與半貼壁的細胞，用無酚紅的L-15培養基培養備用。

1.2.3 氧呼吸爆發(ROS)的檢測 備用的細胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細胞培養基培養，每個濃度設置3個重復，將細胞置于28 ℃培養24 h，隨后每孔加入0.1 μg/cm3PMA，刺激1 h后棄去培養基，加入10 μmol/dm3的DCFH-DA(用無血清培養液按體積比為1∶1 000稀釋)。28 ℃細胞培養箱內孵育20 min，棄去培養液，用PBS清洗細胞3次，每孔加入胰酶700 mm3消化細胞5 min，棄去胰酶，用細胞刮刮下細胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 氮呼吸爆發(NO)的檢測 備用的細胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細胞培養基培養，每個濃度設置3個重復，將細胞置于28 ℃培養24 h。處理結束后棄去培養液，加入5 μmol/dm3的DAF-FM DA(用DAF-FM DA稀釋液按體積比為1∶1 000稀釋)。28 ℃細胞培養箱內培養20 min。棄去培養液，用PBS清洗細胞3次，每孔加入700 mm3胰酶消化細胞5 min，棄去胰酶，用細胞刮刮下細胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 APS對LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細胞吞噬活性檢測 備用的細胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細胞培養基培養，每個濃度設置3個重復，將細胞置于28 ℃培養24 h，處理結束后棄去培養基，加入 LPS濃度為20 μg/cm3的培養基，培養3 h后，在每個孔內加入1 mm3FITC-熒光微球，28 ℃培養箱避光培養1 h。用PBS清洗細胞3次，每孔加入胰酶700 mm3消化細胞5 min，棄去胰酶，用細胞刮刮下細胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達 將大黃魚頭腎巨噬細胞用200 μg/cm3的APS處理，同時設立空白對照。于處理后6、12、24 h時按照細胞總RNA提取試劑盒操作說明收集細胞RNA。用天根反轉錄試劑盒反轉成cDNA。實時熒光定量PCR反應按Promega公司生產的Go Taq? qPCR Master Mix 進行。使用實時熒光定量PCR得到各樣品的Ct值后，以β-actin為內參，對樣品Ct值作均一化處理，通過2-△△Ct計算各個樣品mRNA相對含量。TNF-α上游引物：5′-GGACGATTCTTCGTTTACAG-3′，下游引物：5′-GTTTGTCACCTCTGTTCAGG-3′；IL-1β上游引物：5′-CAGCTGTTCTCAAGTATGTGGC-3′，下游引物：5′-GTTGTAAATAGTGGGTGTGTCG-3′；IL-6上游引物：5′-GCTGTTCTCAAGTATGTGGCG-3′，下游引物：5′-TGTTGTAAATAGTGGGTGTGTCG-3′；β-actin上游引物：5′-GACCTGACAGACTACCTCATG-3′，下游引物：5′-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGGA-3′，3條魚重復。

1.3 數據分析

采用SPSS軟件對數據進行單因子方差分析，用LSD判定組間的差異性，用FlowJo軟件對流式細胞儀測得數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 APS對大黃魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發影響

如圖1a所示，隨著APS濃度的增加，DCFH-DA的熒光強度明顯下降，且呈劑量依賴性。通過對其平均熒光值進行差異性分析，結果如圖1b所示，50、100、200、400、800 μg/cm3APS均可極顯著地抑制活性氧的產生(p<0.01)。

圖1 不同濃度APS對大黃魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發的影響

2.2 氮呼吸爆發的檢測

用流式細胞儀檢測APS對大黃魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發的影響，結果如圖2a所示，與Ⅰ峰相比(空白)，各峰逐漸向其左方偏移，且偏移程度隨APS濃度增大而增大。通過對其平均熒光值進行差異性分析，結果如圖2b所示，不同濃度APS作用大黃魚頭腎巨噬細胞24 h后，100 μg/cm3APS能夠顯著地抑制細胞NO的產生(p<0.05)，200、400、800 μg/cm3的APS能夠極顯著地抑制細胞NO的產生(p<0.01)，且呈劑量依賴性。50 μg/cm3APS與空白組相比無顯著性差異。

圖2 不同濃度APS對大黃魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發的影響

2.3 APS對經LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細胞吞噬活性的影響

頭腎巨噬細胞具有吞噬熒光微球的能力，如圖3a所示，峰越往右表示其吞噬微球數目增多。用50、100、200 μg/cm3APS 預處理24 h后發現，與Ⅱ峰(LPS刺激)相比，熒光強度明顯升高，則說明細胞吞噬熒光微球數量增多，400、800 μg/cm3APS處理組與Ⅱ峰相比差異不明顯。通過對其平均熒光值進行差異性分析，結果如圖3b所示，50、100 μg/cm3的APS預處理24 h后可以極顯著地增強大黃魚頭腎巨噬細胞經過LPS刺激后的吞噬能力(p<0.01)，200 μg/cm3APS可以顯著增強細胞經LPS刺激后的吞噬能力(p<0.05)，400、800 μg/cm3APS刺激后與單純 LPS刺激組相比無顯著性差異。

圖3 不同濃度APS對經LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細胞吞噬活性的影響

2.4 RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達

APS對大黃魚頭腎巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA轉錄水平影響如圖4所示，在采用200 μg/cm3的APS刺激大黃魚頭腎巨噬細胞后，3種細胞因子的轉錄水平在6、12、24 h均極顯著上升(p<0.01)，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA轉錄水平在6 h升高最明顯，隨著刺激時間增長，升高趨勢逐漸降低。

圖4 APS對大黃魚頭腎巨噬細胞免疫相關基因表達水平影響

2.5 討論

頭腎是大黃魚免疫細胞的主要發源地之一，這些免疫細胞包括單核/巨噬細胞、顆粒細胞和B淋巴細胞等，其中頭腎巨噬細胞在魚類抵御微生物感染的各個階段發揮重要作用[13]。多糖是一種重要的生物大分子，在機體內參與各種生命現象的調節和能量的儲存與傳遞[14-16]。研究表明，植物多糖可以通過激活免疫細胞、活化補體、促進細胞因子生成等方面對免疫系統進行調節[17]。

氧是細胞發揮作用所必不可少的成分，但氧過量時會發生單價還原而產生活性氧類。活性氧是指機體在進行生命活動中產生的一些代謝產物，大部分細胞中90%以上的氧在線粒體中被消耗，其中約2%的氧在線粒體內膜和基質中被轉變成為活性氧。活性氧主要包括：超氧陰離子、單線態氧、次氯酸、羥自由基、過亞硝酸鹽、過氧化氫等。活化的巨噬細胞會產生呼吸爆發，消耗大量的氧同時產生過量的活性氧自由基。過量的活性氧會損害細胞正常的雙層膜結構，對細胞器的結構和功能造成破壞，繼而損傷脂質、蛋白質等生物大分子，最終導致自身凋亡[18]。李明春等(2000)發現靈芝多糖GLB7可以減少小鼠腹腔巨噬細胞內活性氧自由基的生成，清除活性氧，從而達到免疫增強與抗衰老的目的[19]。張慶等(2000)也發現大棗中性多糖具有抗活性氧作用，減少其對細胞所產生的損傷作用[20]。本研究通過用APS對大黃魚頭腎巨噬細胞處理24 h后發現，不同濃度APS均可以顯著抑制頭腎巨噬細胞經PMA誘導后的氧呼吸爆發活性。

本研究結果表明，APS還可以抑制頭腎巨噬細胞的氮呼吸爆發活性，抑制效果隨濃度增加而增加。NO是巨噬細胞產生的效應分子之一，它是由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)產生。適量的NO可以增強巨噬細胞的免疫功能，但是過量的NO會產生細胞毒性作用，損傷細胞、導致基因突變。歐德淵等(2007)研究顯示APS可以使仔豬腹腔巨噬細胞中NO的含量顯著降低[21]，與本研究結果一致。

巨噬細胞的吞噬功能是其最主要的細胞功能，是其識別并消滅病原體、清除衰亡細胞、維持機體內環境穩態的重要手段。本研究結果顯示，50、100、200 μg/cm3APS可以顯著增強LPS刺激的大黃魚頭腎巨噬細胞吞噬活性，說明APS預處理可以通過提高大黃魚頭腎巨噬的吞噬活性來提高機體對病原菌的免疫力。

已有研究表明，APS可以增強豬外周血樹突狀細胞IL-1β和TNF-α的表達量，并顯著增強IL-6的表達量[22]。曹麗萍等(2008)在對鯉魚頭腎巨噬細胞的研究中也發現，APS能顯著增強IL-1β的表達量[23]。TNF-α、IL-1β、IL-6是巨噬細胞分泌重要的細胞因子，是其發揮免疫功能必不可少的活性物質[24]。在本研究中，200 μg/cm3的APS能夠顯著增強大黃魚頭腎巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達，說明APS可以通過增強細胞因子的表達對巨噬細胞發揮免疫調節作用。

3 結論

本研究表明APS可以抑制大黃魚頭腎巨噬細胞的呼吸爆發活性，增強經LPS刺激的巨噬細胞的吞噬活性，提高巨噬細胞TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表達量，從而對大黃魚頭腎巨噬細胞發揮免疫調節作用。