牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留同步快速檢測的酶聯免疫吸附法研究

李燕君，譚梅，岳秀英，陸強，吳曉嵐，呂曉華*

(1.四川大學華西公共衛生學院/四川大學華西第四醫院，四川 成都 610041；2.四川省獸藥監察所，四川 成都 610041)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，FQs)是目前廣泛應用于畜牧業的第三代喹諾酮類藥物，由于耐藥性致病菌的產生、繼發的不良反應及潛在致癌作用，FQs殘留問題受到各國的高度關注[1-3]。本文探索一種快速同步檢測牛奶中多種FQs殘留的酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，為基層現場監測牛奶中FQs殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品 牛奶樣品，購于超市。

1.2 主要儀器 Thermo Multiskan Go酶標儀(配備450 nm濾光片)(Thermo)，CPA225D電子天平(賽多利斯)，X-200漩渦混合儀(Labnet)，Eppendorf 5810R冷凍離心機(Eppendorf)，單道和多道微量移液器(Eppendorf)。

1.3 標準品和主要試劑 氟喹諾酮類藥物殘留酶聯免疫檢測試劑盒(北京勤邦生物技術有限公司)，試劑盒中提供0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物系列標準溶液，試驗用水符合GB/T 6682-2008規定。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理 準確量取25 μL牛奶于2 mL離心管中，加入稀釋后復溶工作液475 μL，混合，用渦旋儀渦動1 min，取50 μL用于分析。

1.4.2 檢測方法 所有操作均在20℃～25℃下進行。

使用前將試劑盒置于室溫(20 ℃～25 ℃)平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前搖勻，取出需要數量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2 ℃～8 ℃，將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品做兩個平行實驗；加入50 μL標準溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50 μL抗體工作液和酶標二抗濃縮液的混合液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25 ℃避光環境中反應30 min；倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體，每孔加250 μL洗滌液，10 s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次；加入50 μL底物溶液A和50 μL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻25℃環境避光顯色15 min；加入50 μL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。

1.4.3 50%抑制濃度 50%抑制濃度可評價檢測方法的靈敏度[4]。分別測定10次標準曲線的50%抑制濃度。標準曲線中10次0濃度的標準液50%抑制處所對應的藥物濃度值，即為50%抑制濃度。

1.4.5 加標回收試驗 在牛奶樣品加入FQs系列標準溶液，分別配制5.0、25.0和50.0μg/L 三個添加濃度，ELISA法測定樣品中FQs含量。每批(日內)每一濃度重復測定5次，共做3個批次(日間)。計算各質量濃度的批內和批間變異系數(CV)。

2 結果與分析

2.1 ELISA法的50%抑制濃度和最低檢測限 如表1所示，ELISA法的50%抑制濃度的范圍在0.254～0.361μg/L。ELISA法的最低檢測限為1.48μg/L。

表1 ELISA法的50%抑制濃度

2.2 ELISA法的加標回收率 如表2所示，在牛奶中添加5μg/L環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為87.20%～115.92%；添加25 μg/L 環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為84.58%～112.91%；添加50 μg/L環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為87.10%～113.28%。

2.3 ELISA法的加標試驗的批內和批間變異系數 如表2所示，在環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物添加濃度為5、25、50 μg/L時，批內變異系數均小于15.0%，批間變異系數均小于16.0%。

表2 ELISA法的加標回收試驗結果

續表

3 討論與結論

FQs是一類重要的獸用抗菌藥，對金黃色葡萄球菌等多種細菌有很強的抗菌活性，常被用作治療奶牛乳房炎等疾病[4]。研究表明，FQs殘留可通過食物鏈進入人體，對人體多系統造成損傷，并導致耐藥性致病菌的產生[5]。FQs在禽畜體內具有良好的藥代動力學特征，可穿過血乳屏障進入乳腺，在泌乳動物乳汁中呈聚集現象[6]。我國農業部雖已規定了牛/羊奶中恩諾沙星的最大殘留限量(Maximum residue limits, MRLs)為100 μg/kg，達氟沙星的MRLs為30 μg/kg[7]，但由于奶牛泌乳期超量、盲目或不按休藥期規定等濫用FQs，牛奶中FQs殘留超標問題依舊嚴重。在基層工作中，經常面臨現場對大量樣品的檢測，因此，探索FQs多殘留的快速檢測方法十分必要。

目前國內外常用的獸藥殘留檢測技術有確證法和篩檢法[8]。確證法主要包括高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯用法等，因其檢測結果穩定、準確度高、重現性好，廣泛應用于動物性食品的獸藥殘留分析中[9-13]。但確證法儀器昂貴，前處理復雜、檢測時間長、操作繁瑣，使得其無法滿足大樣本量的快速檢測。篩選法中膠體金試紙條快速檢測法雖檢測時間短，但由于檢測限高、靈敏度差、假陽(陰)性率偏高，難以保證結果的準確可靠性[13]；而ELISA法靈敏度高、特異性強、分析成本低、操作簡便快捷，試劑盒檢測時間僅約1.5 h，且樣本儀器化程度低、前處理簡單，尤其適合于現場大批量樣品的快速檢測，極易在基層推廣[14]。目前已有用于豬肉、牛肉、雞蛋、牛奶等中FQs殘留檢測的報道[15-18]，然而已有的ELISA法僅對某一種或一類FQs藥物進行殘留檢測，且靈敏度、準確度有待提高，因此有必要進一步探索大批量快速檢測牛奶中多種FQs殘留的ELISA法。

本文建立了一種同時測定牛奶中環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星等六種FQs殘留的ELISA法，試驗結果表明，本文所建立的ELISA法的最低檢測限為1.48 μg/L，50%抑制濃度的范圍在0.254～0.361 μg/L，在環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物添加濃度為5、25、50 μg/L時的回收率為84.58%～115.92%，批內變異系數均小于15.0%，批間變異系數均小于16.0%，該方法的精密度(變異系數)、回收率和最低檢測限等均符合獸藥殘留試驗技術規范的要求[19]，且回收率和最低檢測限與高效液相色譜法[20]、高效液相色譜-串聯質譜法[21]接近，優于現常用的高效液相色譜熒光檢測法[22-23]，具有較高的靈敏度、準確度，極易在基層工作中推廣普及，適合大批量樣本的快速檢測。

綜上，氟喹諾酮類藥物殘留同步快速檢測的酶聯免疫吸附法符合獸藥殘留試驗技術規范的要求，簡便快捷，靈敏度、準確度和精密度高，適用于牛奶中FQs殘留的快速檢測。