紫云英季土壤固氮微生物對外源碳氮投入的響應(yīng)

楊璐，曾鬧華，白金順，周興，周國朋，高嵩涓，聶軍，曹衛(wèi)東,

紫云英季土壤固氮微生物對外源碳氮投入的響應(yīng)

楊璐1,2，曾鬧華2，白金順2，周興3，周國朋1,2，高嵩涓4，聶軍5，曹衛(wèi)東2,4

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，長沙 410125；4南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095；5湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，長沙 410125）

【】分析不同外源有機(jī)物料（稻草、葡萄糖）及氮素投入對紫云英季土壤固氮微生物的調(diào)控作用，為我國南方紫云英-水稻輪作體系中秸稈還田及化肥減施增效提供支持。采用盆栽試驗(yàn)，共設(shè)7個(gè)處理，即CK（對照，不添加有機(jī)物料和氮）、稻草等量添加并配施不同量氮素（分別表示為Rs、RsN1和RsN2，對應(yīng)C/N比分別為66、25和13）；等秸稈碳量添加葡萄糖并配施不同量氮素（即Glc、GlcN1、GlcN2）、調(diào)整C/N比與秸稈添加相應(yīng)處理保持一致。采集紫云英快速生長期土壤樣品，利用Illumina Miseq PE300高通量測序和絕對定量PCR技術(shù)分析固氮功能基因及固氮微生物群落特征。單獨(dú)添加外源秸稈或葡萄糖處理的土壤C/N與對照無明顯差異，但增施氮肥后C/N比呈下降趨勢，GlcN2處理土壤C/N顯著低于對照；對于土壤速效養(yǎng)分，Rs和RsN1處理土壤NO3--N含量與CK類似，但RsN2處理明顯增加了60%；而添加葡萄糖處理土壤NO3--N含量整體較高（增幅為35%—79%）；稻草單獨(dú)添加或與氮素配施對土壤速效磷含量無明顯影響，添加葡萄糖處理則顯著降低其含量，降幅為16%—24%，但不同氮水平之間無明顯差異。不同處理土壤基因拷貝數(shù)為80.4×106—140.5×106g-1土，稻草和葡萄糖添加處理基因拷貝數(shù)較CK呈增加趨勢，而增施氮素后有所下降。外源碳、氮添加導(dǎo)致固氮微生物α-多樣性較CK整體降低，但α-多樣性對氮素的響應(yīng)因碳源種類而異，即稻草添加后增加氮素供應(yīng)（RsN1和RsN2）處理土壤固氮微生物物種數(shù)目和Chao 1指數(shù)較Rs顯著降低，降低幅度分別為6%—11%和13%—15%，而添加葡萄糖后增施氮肥則對α-多樣性有一定促進(jìn)作用。PCoA結(jié)果顯示土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)主要因碳源種類差異而聚集為不同組別，受氮水平供應(yīng)的影響相對較小。屬水平上不同物種對外源碳、氮添加的響應(yīng)存在明顯差異：慢生根瘤菌（）相對豐度最高，而外源碳、氮添加后較CK明顯降低，且稻草添加處理的降低幅度（12.3%—19.7%）小于葡萄糖添加處理（31.6%—40.5%）；第二優(yōu)勢菌屬（地桿菌，r）對碳源添加的響應(yīng)趨勢與相反，與CK相比，葡萄糖添加處理相對豐度的增加幅度（170%—270%）明顯大于秸稈添加處理（25.0%—54.6%）。同時(shí)，多元回歸樹、RDA及相關(guān)性分析表明土壤固氮微生物豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成主要受土壤NO3--N和速效磷的影響較大。氮素供應(yīng)對固氮微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用受碳源種類（或秸稈和葡萄糖中碳源有效性差異）影響；同時(shí)，不同碳源添加后造成土壤速效磷含量的差異也可能是影響紫云英季土壤固氮微生物群落組成的重要環(huán)境因子。

固氮微生物；水稻秸稈；葡萄糖；氮；紫云英；

0 引言

【研究意義】紫云英（L.）一直以來是我國南方普遍種植的豆科綠肥，在水稻休閑期種植紫云英，能夠充分利用光、水、熱等資源；同時(shí)，利用其生長階段生物固氮可補(bǔ)充土壤氮庫，減少水稻季氮素投入[1]。據(jù)報(bào)道，紫云英體內(nèi)氮素有78%來自生物固氮[2]。生物固氮是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素投入的重要途徑之一，據(jù)估計(jì)每年生物固氮量可達(dá)4 000— 7 000萬t[3-4]。固氮微生物是土壤中參與生物固氮的重要成員，系統(tǒng)發(fā)育和代謝過程復(fù)雜而多樣化[5-7]，且對環(huán)境變化十分敏感[8]。維持土壤固氮微生物的多樣性并充分發(fā)揮其固氮能力，增加綠色氮源投入，對農(nóng)田化肥減施和農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】固氮微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化，能夠較好地反應(yīng)其生物固氮能力[9]，但外源化肥、有機(jī)肥投入、秸稈還田等帶來的土壤環(huán)境變化，都會對固氮微生物生長和功能發(fā)揮造成影響[10-13]。目前關(guān)于不同外源物料投入對土壤固氮微生物的促進(jìn)或抑制作用均有報(bào)道。長期施用化肥能夠顯著影響固氮微生物豐度和群落組成[14]或并無明顯作用[15]。由于土壤中多數(shù)參與N2固定的微生物屬于化能異養(yǎng)型，外源有機(jī)物料添加能夠?yàn)槠涮峁┐罅刻荚春湍茉矗室话阏J(rèn)為有機(jī)物料添加對固氮微生物具有促進(jìn)作用[16]。但因有機(jī)物料質(zhì)量（C/N）不同，該影響效果各異，如農(nóng)家肥、城市生活廢棄物堆肥、水稻秸稈3種不同C/N比物料相比，農(nóng)家肥C/N比相對較低，對土壤固氮酶活性的影響相對較小，比不施肥對照降低14%；城市生活垃圾堆肥氮含量相對較高，較大程度地抑制了生物固氮（降低50%）；而高C/N比的稻草秸稈，則使土壤固氮酶活性比對照增加了40%[17]。稻草秸稈還田可以增強(qiáng)生物固氮能力[18-19]或增加固氮基因（）豐度[20-21]，可能與秸稈還田后短期內(nèi)導(dǎo)致土壤速效氮含量降低有關(guān)。此外，底物有效性是導(dǎo)致微生物群落競爭的重要因子[22]，微生物對不同碳源的利用能力也存在差異，如固氮厭氧菌對葡萄糖和纖維素添加響應(yīng)不同[23]。【本研究切入點(diǎn)】上述研究結(jié)果表明，土壤固氮微生物對外源有機(jī)、無機(jī)物料添加或底物的數(shù)量及質(zhì)量的響應(yīng)存在差異。近年來，隨著機(jī)械化生產(chǎn)進(jìn)程的推進(jìn)，我國南方紫云英-水稻輪作體系中，稻草和紫云英聯(lián)合還田成為稻田重要的作物殘?bào)w利用方式，二者代表了兩種不同質(zhì)量的有機(jī)物料投入；同時(shí)，化肥施用也能夠調(diào)節(jié)還田物料的C/N比及有機(jī)物料的腐解過程。目前，關(guān)于不同有機(jī)無機(jī)物料投入對紫云英季土壤固氮微生物對的影響已有相關(guān)報(bào)道[24]，但上述措施（如還田物料的碳源有效性及C/N比）對紫云英生長季土壤固氮微生物的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】擬通過盆栽試驗(yàn)，探討紫云英生長期間土壤固氮微生物對不同碳源有效性的有機(jī)物料（秸稈和葡萄糖）配合氮素添加的響應(yīng)規(guī)律，為我國南方紫云英-水稻輪作體系中秸稈和氮肥管理及豆科綠肥固氮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2017年10月至2018年4月年在湖南省長沙市（湖南省土壤肥料研究所網(wǎng)室）進(jìn)行。供試土壤采自稻田0—20 cm耕層，土壤類型為洞庭湖地區(qū)典型水稻土（河流沉積物發(fā)育而來的紫潮泥）。土壤基礎(chǔ)理化性狀為：pH (H2O) 8.00，土壤有機(jī)碳（SOC）18.7 g·kg-1，土壤全氮（TN）2.1 g·kg-1，速效磷19.0 mg·kg-1，速效鉀84.9 mg·kg-1。

試驗(yàn)共7個(gè)處理，分別為：（1）對照CK，不添加外源有機(jī)物料、不施氮肥；（2）Rs，僅添加水稻秸稈，C/N = 66；（3）RsN1，添加等量水稻秸稈+低量氮肥，將底物調(diào)至C/N=25；（4）RsN2，添加等量水稻秸稈+高量氮肥，將底物調(diào)至C/N = 13；（5）Glc，等秸稈碳量添加葡萄糖，并加微量氮素調(diào)至底物C/N= 66；（6）GlcN1，等秸稈碳量添加葡萄糖+低量氮肥，將底物調(diào)至C/N=25；（7）GlcN2，等秸稈碳量添加葡萄糖+高量氮肥，將底物調(diào)至C/N=13。每個(gè)處理重復(fù)4次，完全隨機(jī)排列。紫云英品種湘紫1號。試驗(yàn)所用稻草碳（C）、氮（N）、磷（P）和鉀（K）含量分別為40%、0.60%、0.055%、2.07%。試驗(yàn)每盆裝風(fēng)干土10 kg，稻草添加量為40 g/盆，裝盆時(shí)將秸稈剪碎至1—2 cm。葡萄糖添加量為40 g/盆，與秸稈等碳量添加，并補(bǔ)充氮素調(diào)至相應(yīng)C/N比。所有處理等磷（P2O5）、等鉀（K2O）添加。不同處理具體外源物料添加量如表1所示。

1.2 樣品采集及指標(biāo)測定

于2018年3月10日紫云英快速生長期取樣，將去除紫云英植株后的土壤混合均勻。一部分4℃保存，待測完無機(jī)氮后，風(fēng)干磨細(xì)用于其他土壤基本理化性狀測定，其中NO3--N和NH4+-N采用1 mol·L-1KCl 浸提，AA3連續(xù)流動分析儀測定；土壤速效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀用1 mol·L-1醋酸銨浸提，原子吸收儀測定；土壤pH用快速pH測定儀測定（土水比=1﹕2.5），土壤全氮和有機(jī)質(zhì)分別采用凱氏定氮法和K2Cr2O7氧化外加熱法[25]。另一部分存于-80℃，用于土壤DNA提取。

1.3 DNA提取，PCR擴(kuò)增和克隆

采集的土壤樣品送至北京奧維森基因科技有限公司利用Illumina Miseq PE300平臺進(jìn)行測序分析。采用PowerSoil? DNA Isolation kit（MO BIO Laboratories, Inc., CA, USA）試劑盒，按操作步驟說明提取土壤DNA。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測DNA提取質(zhì)量和濃度。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶8-bp Barcode 的特異引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。上游引物為AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC，下游引物為TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)32次，循環(huán)結(jié)束后72℃保持7 min，4℃條件下結(jié)束，收集數(shù)據(jù)。將同一樣本3次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）定量檢測，最后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。混合后的樣品進(jìn)行Miseq測序，測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（SRA accession: PRJNA542599）。

表1 各處理外源有機(jī)物料及氮磷鉀添加量（每盆裝10 kg風(fēng)干土）

1.4 絕對定量PCR (qPCR)

本研究采用絕對定量PCR分析土壤DNA樣品基因拷貝數(shù)。先用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列同上），目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA連接，菌落PCR鑒定陽性克隆，并提取質(zhì)粒作為絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品。再將標(biāo)準(zhǔn)品從101—105進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度取2 μL做模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣品時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品同時(shí)進(jìn)行PCR 循環(huán)，PCR反應(yīng)體系配置如下：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10 mmol·L上游引物和下游引物各0.5 μL，加水至18 μL。加入2 μL DNA后，按以下程序進(jìn)行PCR：95℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光））結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得待測樣品中基因拷貝數(shù)。

1.5 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析等由北京奧維森基因科技有限公司完成，原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進(jìn)行OTU聚類及注釋，其中OTU劃分基于核苷酸序列97%相似性水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理

不同處理對土壤理化性狀、基因拷貝數(shù)、Alpha多樣性的影響采用SAS package 9.1 （SAS Institute，Cary，NC，USA）進(jìn)行ANOVA分析，LSD（＜0.05）進(jìn)行差異比較；土壤理化性狀對nifH基因拷貝數(shù)的相對影響作用采用R中的“relweights”包[26]進(jìn)行權(quán)重分析；土壤理化性狀與功能菌屬Spearman相關(guān)關(guān)系采用R中的“PerformanceAnalytics”包分析；群落結(jié)構(gòu)差異及環(huán)境因子對群落結(jié)構(gòu)影響的主坐標(biāo)（PCoA（基于Bray-Curtis距離矩陣））和冗余分析（RDA）由R中的“Vegan”包完成；R中‘mvpart’包[27]用于多元回歸樹分析。做圖軟件為Microsoft Excel、Sigmaplot和R中“ggbur”包。

2 結(jié)果

2.1 外源碳、氮添加對土壤理化性狀的影響

由表2可知，秸稈、葡糖糖和氮素添加各處理土壤pH與對照相比無明顯差異。與對照相比，RsN2、Glc和GlcN1處理土壤有機(jī)質(zhì)含量以及RsN2和GlcN2處理土壤全氮含量明顯增加；盡管各處理土壤C/N與對照無明顯差異，但增施氮肥后C/N比呈下降趨勢。對于土壤速效養(yǎng)分，Rs和RsN1處理NO3--N含量與CK類似，但RsN2處理明顯增加了60%；而添加葡萄糖處理土壤NO3--N含量整體較高（增幅為35%—79%）；稻草單獨(dú)添加或與氮素配施對土壤速效磷含量無明顯影響，添加葡萄糖處理則顯著降低16%—24%，但不同氮水平之間無明顯差異。秸稈或葡萄糖添加對土壤速效K影響相對較弱，但隨著氮素添加量的增加，速效鉀含量呈下降趨勢。

表2 外源C、N添加對紫云英快速生長期土壤理化性狀的影響

表格中表格數(shù)據(jù)為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤，= 4；同一列不同字母表示處理之間差異顯著（＜0.05）

Data are means ± SE,=4. Means with no letter in common are significantly different among treatments at＜0.05 level

2.2 固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)及α-多樣性

與CK 相比，Glc處理基因拷貝數(shù)增加了1.1倍，其他添加稻草或葡萄糖處理拷貝數(shù)也均一定程度增加，但差異不顯著；增施氮肥后拷貝數(shù)呈下降趨勢（表3）。對于固氮微生物α-多樣性，稻草單獨(dú)添加處理（Rs）有利于增加固氮微生物α-多樣性，其中Chao 1指數(shù)增加明顯；添加稻草后增施氮肥明顯抑制了固氮微生物α-多樣性，RsN1和RsN2處理chao 1指數(shù)比Rs處理分別降低12.5%和15.1%，物種數(shù)目降低6.5%和11.2%。添加葡萄糖處理與CK相比，固氮微生物α-多樣性整體較低。與添加稻草處理相比，添加葡萄糖后增施氮肥固氮微生物α-多樣性呈增加趨勢，其中GlcN2與Glc相比增加幅度達(dá)顯著水平（表3）。

表3 外源碳、氮添加對土壤固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)及α-多樣性的影響

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（= 4）。圖中不同字母表示各處理之間差異顯著（＜0.05）

Data are means±SE (=4). Means with no letter in common indicate significant differences among treatments (＜0.05)

權(quán)重分析結(jié)果表明，所檢測的土壤環(huán)境因子中，土壤速效氮、有機(jī)質(zhì)、速效鉀和C/N對基因拷貝數(shù)的相對影響作用大于其他理化性質(zhì)（圖1）；多元回歸分析表明，土壤NO3--N是導(dǎo)致不同處理之間α-多樣性差異的主導(dǎo)因子（圖2）。

2.3 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)

基于Bray-cruits 距離的PCoA分析結(jié)果表明，不同碳、氮添加處理土壤固氮微生物群落聚集為4組（Group），其中Group 1包含CK、Rs和RsN2處理，Group 2包含RsN1處理，Group 3包含Glc和GlcN1處理，Group 4包含GlcN2處理（圖3-A）。相似性分析（ANOSIM）表明，不同組別之間群落結(jié)構(gòu)差異顯著（=0.001）。群落結(jié)構(gòu)組成同環(huán)境因子的冗余分析（RDA）結(jié)果表明，所檢測的環(huán)境因子對土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)差異解釋量為39.9%，RDA1和RDA2解釋量分別為23.9%和4.9%；土壤環(huán)境因子中速效磷（=4.70，=0.001）和pH（=2.02，=0.05）的影響作用達(dá)到顯著（圖3-B）。

2.4 土壤固氮微生物優(yōu)勢功能菌屬

所有處理土壤在屬水平上共鑒定出160種固氮菌，包含26個(gè)優(yōu)勢功能均屬（相對豐度大于1%），其中20個(gè)菌屬對外源碳、氮添加響應(yīng)明顯，包括多種α-型、β-型、δ-型和γ-型變形菌和一種藍(lán)藻細(xì)菌，如眉藻屬（圖4）。慢生根瘤菌（）為最豐富菌屬，CK中占23.6%，添加稻草處理后降低至19%—21%，而添加葡萄糖后明顯降低至14%—16%，但受氮水平影響較小。秸稈或葡萄糖添加明顯增加了和等菌屬的相對豐度，其中秸稈添加處理相對豐度較CK平均增加了36.5%，而葡萄糖添加平均增加了2倍，增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于秸稈添加處理，且施氮量增加（C/N降低）相對豐度明顯降低；也表現(xiàn)出類似的規(guī)律。此外，與CK比較，秸稈添加處理的相對豐度整體呈增加趨勢，隨氮素添加量增加而呈增加趨勢，而葡萄糖添加后相對豐度降低了約22%。

圖1 土壤理化性狀對nifH基因拷貝數(shù)影響的權(quán)重分析

圖2 固氮微生物α-多樣性與土壤理化性狀的多元回歸樹分析

相關(guān)性分析表明，屬水平上大多數(shù)優(yōu)勢土壤固氮微生物相對豐度與土壤速效磷顯著相關(guān)（圖5）。、、和等優(yōu)勢功能菌屬的相對豐度均與土壤速效磷呈顯著正相關(guān)，而r等則與其呈顯著負(fù)相關(guān)；土壤pH及C/N與屬水平相對豐度的相關(guān)性趨勢和速效磷類似，但僅有少數(shù)菌屬達(dá)到顯著水平。屬相對豐度與土壤SOM、TN、NO3--N含量的響應(yīng)也較為敏感，但趨勢則與對速效磷的響應(yīng)相反，如、和相對豐度與SOM顯著負(fù)相關(guān)。屬相對豐度與土壤速效鉀和NH4+-N含量的相關(guān)性較弱（圖5）。多元回歸樹分析進(jìn)一步表明，稻草和葡萄糖添加處理后土壤固氮微生物屬水平相對豐度的差異主要受速效磷驅(qū)動（圖6）。

圖3 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)差異的 PCoA分析（A）及其與環(huán)境因子的RDA分析（B）

圖4 不同處理土壤固氮微生物優(yōu)勢功能菌屬相對豐度

圖5 土壤固氮微生物優(yōu)勢功能菌屬與土壤理化性狀的Spearman相關(guān)性分析

圖6 土壤固氮微生物優(yōu)勢功能菌屬與土壤理化性狀的多元回歸樹分析（MRT）

3 討論

由于土壤中固氮微生物多為化能異養(yǎng)型，故外源有機(jī)物料添加能夠?yàn)槠涮峁┐罅刻荚春湍茉矗欣谏锕痰猍16]。與此一致，本研究中秸稈和葡萄糖添加處理基因拷貝數(shù)呈增加趨勢（表3）；但氮素添加（即C/N降低）減弱了這種趨勢，這可能與增加氮素有效性一定程度抑制固氮活性有關(guān)[24, 28]。與拷貝數(shù)相反，外源碳、氮添加降低了固氮微生物α-多樣性（Rs單獨(dú)添加處理Chao 1指數(shù)明顯高于CK除外），但是α-多樣性對氮素的響應(yīng)因碳源不同（秸稈和葡萄糖）而表現(xiàn)不同，即增加氮素供應(yīng)顯著降低了秸稈處理中α-多樣性，但添加葡萄糖后增施氮肥則一定程度增加了α-多樣性（表3）。上述結(jié)果表明，碳源種類及C/N比是影響土壤固氮微生物α-多樣性的關(guān)鍵因素。

盡管高C/N更有利于微生物固氮活性[17,29]，但C/N比并不能代表添加物料對微生物生長所需C源和N源的數(shù)量及有效性[30]。底物有效性是導(dǎo)致微生物群落競爭的重要因子[22]，很大程度決定了有機(jī)物料微生物活性和結(jié)構(gòu)組成[31-32]。盡管不少研究指出，有機(jī)物料添加有利于促進(jìn)基因豐度及固氮功能的維持[20-21,33]，但有機(jī)物料對固氮微生物的影響可能也與有機(jī)物料的數(shù)量和質(zhì)量相關(guān)[33-34]。LIN等[35]指出，花生、水稻和蘿卜等植物殘?bào)w投入對固氮微生物結(jié)構(gòu)沒有顯著影響，但豬糞配施化肥后群落組成明顯異于對照和單施化肥處理。WU 等[36]也指出，微生物對堆肥和生物炭的響應(yīng)差異，一定程度上由生物炭添加處理中可溶性碳較低、不利于微生物利用所致。這些研究表明，微生物對不同碳源利用能力存在差異，因而對不同碳源的響應(yīng)也有所區(qū)別。

本研究中PCoA結(jié)果表明，土壤固氮微生物群落因添加碳源不同（葡萄糖、秸稈）而聚集為不同組別（圖3-A）。通常，革蘭氏陽性菌傾向于利用相對復(fù)雜的碳底物[37]，而革蘭氏陰性菌則喜好利用簡單結(jié)構(gòu)的碳源[38]。葡萄糖較秸稈是一種更容易利用的C源，更容易被微生物吸收利用，微生物對其響應(yīng)也可能更為敏感。與對照（CK）比較，葡萄糖添加處理相對豐度平均降低了35.8%，降低幅度明顯大于添加秸稈處理（15.3%）；而第二優(yōu)勢菌屬相對豐度的增加幅度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于秸稈添加處理（124.8%26.7%）；同時(shí)，秸稈添加有增加相對豐度的趨勢，而葡萄糖添加則表現(xiàn)為降低。其他研究也發(fā)現(xiàn)厭氧固氮菌對葡萄糖和纖維素的響應(yīng)不一致[21]，進(jìn)一步表明秸稈和葡萄糖添加后，由于二者所含碳水化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度懸殊，導(dǎo)致碳源有效性明顯不同，進(jìn)而影響土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。

外源物料投入對固氮微生物的影響，可直接通過添加的碳源、能源和養(yǎng)分實(shí)現(xiàn)，或通過影響土壤環(huán)境因子來間接調(diào)控。氮素是微生物生長和代謝所必須，施肥等措施能夠提升土壤有效氮含量，但一般抑制土壤固氮酶活性[10-11]；而氮素缺乏又可能限制微生物的生長[14,29]。本研究中外源碳氮添加導(dǎo)致土壤NO3--N增加或顯著增加，無論在添加稻草還是葡萄糖處理中，增加氮素供應(yīng)均導(dǎo)致土壤固氮基因豐度呈降低趨勢（表3）；但是α-多樣性和優(yōu)勢功能菌屬相對豐度對氮素添加的響應(yīng)因碳源而異。如添加秸稈和葡萄糖后增加氮素供應(yīng)，固氮微生物α-多樣性響應(yīng)規(guī)律完全相反（表3）。秸稈添加處理的相對豐度整體呈增加趨勢，隨氮素添加量增加而呈增加趨勢，而葡萄糖添加后相對豐度降低了約22%（圖4）。這些結(jié)果表明，氮素供應(yīng)對固氮微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用受碳源種類（或秸稈和葡萄糖中碳源有效性）影響。生物固氮是一個(gè)十分耗能的過程，固氮微生物需要消耗大量的ATP來完成生物固氮[39]，因而磷養(yǎng)分的供應(yīng)在固氮微生物的生長和功能發(fā)揮中起著著重要作用。本研究RDA分析、Mantel檢驗(yàn)及相關(guān)性分析表明，土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的差異與速效磷含量緊密相關(guān)；而PCoA結(jié)果表明土壤固氮微生物群落因葡萄糖添加和秸稈添加而明顯聚集為不同組別，這與添加葡萄糖處理后土壤速效磷含量顯著低于秸稈處理的結(jié)果相吻合（表2）。而添加秸稈處理組內(nèi)，RsN1處理固氮微生物單獨(dú)聚為一類，可能與該處理土壤速效磷含量較高有關(guān)（表2，圖3-B）。同時(shí)，由于、等相對豐度與土壤速效磷顯著正相關(guān)，而土壤等則與其呈負(fù)相關(guān)，因此，添加葡萄糖處理后相對豐度較秸稈處理明顯降低，而相對豐度卻大幅增加，表明土壤速效磷含量對固氮微生物群落組成具有較強(qiáng)的調(diào)控作用。其他研究通過研究不同形態(tài)磷素及其與葡萄糖添加對固氮微生物的影響發(fā)現(xiàn)，磷有效性決定了固氮微生物的總體固氮潛力，但不同固氮微生物的響應(yīng)可能不同[40]。結(jié)合多元回歸樹分析，上述結(jié)果表明土壤速效磷含量的差異可能是不同碳源（稻草和葡萄糖）添加后驅(qū)動土壤固氮微生物屬水平相對豐度的差異另一個(gè)重要環(huán)境因子[40]（圖6）。本研究中，各處理均為外源養(yǎng)分供應(yīng)均為等磷、等鉀量添加，但添加葡萄糖處理后土壤速效磷含量明顯低于秸稈和對照處理，可能與添加葡萄糖促進(jìn)了其他微生物繁殖，進(jìn)而固持土壤速效磷有關(guān)。

此外，在我國南方紫云英-水稻輪作體系中，稻草還田及種植翻壓紫云英是當(dāng)前提升稻田土壤地力的主要措施之一。禾本科和豆科殘?bào)w質(zhì)量差異較大，二者還田或與氮肥配施后對土壤固氮微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的促進(jìn)、抑制或無明顯影響均有報(bào)道[14-15,24]，這可能與土壤類型、礦質(zhì)養(yǎng)分有效性等環(huán)境因子相關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，土壤固氮微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)對碳源種類或有效性具有明顯響應(yīng)，對稻草和紫云英等有機(jī)物料聯(lián)合還田利用調(diào)控土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要指導(dǎo)意義。然而，由于固氮微生物對環(huán)境變化十分敏感[8]，田間條件下碳源有效性對固氮微生物的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

不同碳源（稻草、葡萄糖）配合氮素添加對紫云英季土壤固氮微生物群落具有明顯影響。添加秸稈和葡萄糖后增施氮肥，土壤固氮微生物基因拷貝數(shù)呈下降趨勢。固氮微生物α-多樣性對氮素供應(yīng)的響應(yīng)在秸稈和葡萄糖處理中不同，即增加氮素供應(yīng)顯著降低了秸稈處理中α-多樣性，而添加葡萄糖后增施氮肥則一定程度增加了α-多樣性。固氮微生物群落結(jié)構(gòu)因碳源類型差異而聚集為不同組別，受氮水平的影響較小。因此，氮素供應(yīng)對固氮微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用主要受碳源種類（或秸稈和葡萄糖中碳源有效性差異）影響。此外，固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢固氮菌屬相對豐度與土壤速效磷含量緊密相關(guān)，表明不同碳源添加后造成土壤速效磷含量的差異也可能是驅(qū)動紫云英季土壤固氮微生物群落組成的重要環(huán)境因子。

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Responses of Soil Diazotroph Community to Rice Straw, Glucose and Nitrogen Addition During Chinese Milk Vetch Growth

YANG Lu1,2, ZENG NaoHua2, BAI JinShun2, ZHOU Xing3, ZHOU GuoPeng1,2, GAO SongJuan4, NIE Jun5, CAO WeiDong2,4

(1Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081;3Crop Research Institute of Hunan Province, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125;4College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;5Soil and Fertilizer Institute of Hunan Province, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125)

【】This study was to reveal the regulating roles of carbon (C) sources (rice strawglucose) and nitrogen (N) addition in soil diazotroph community during growth of Chinese milk vetch (L.), which is crucial for the management of crop residue and mineral fertilizer application in Chinese milk vetch – rice rotation system in southern China. 【】A pot experiment was conducted with seven treatments, including CK (no exogenous C and N addition), rice straw (Rs) plus various rates of N inputs (Rs, RsN1and RsN2, corresponding to C/N ratios of 66, 25 and 13, respectively), and glucose (Glc) addition plus different N rates (Glc, GlcN1, and GlcN2) with same C quantity and C/N ratios in Rs-included treatments. Soils were sampled during the fast-growing phase of Chinese milk vetch, and destined for characterization ofgene marker and diazotroph community by using the Illumina Miseq PE300 sequencing and PCR techniques.【】Soil C/N ratios were similar between the CK and the treatments with straw or glucose addition alone, while tended to decrease with increasing N input, and significant decrease was observed in the GlcN2relative to CK. Regarding to the available nutrients, comparable soil NO3--N contents were observed under treatments of CK, Rs, and RsN1, but it was significantly increased by 60% under the RsN2treatment. Compared to the CK, Glc-included treatments increased soil NO3--N content by 35%-79%. There were limited variations of soil available phosphorous (P) content under the CK and Rs-included treatments. 16%-24% decrease of soil available P content was found in the Glc-included treatments than that under CK, but not affected by N rates. The copy number ofgene ranged from 80.4×106—140.5×106g-1soil under all treatments. Compared to the CK,gene copy number tended to increase under treatments with both Rs and Glc addition, while a downward trend was observed with increasing N inputs. Exogenous C and N addition resulted in an overall decrease of diazotroph α-diversity than that under the CK. The responses of diazotroph α-diversity to N supply differed between C sources (RsGlc). Compared to Rs alone, RsN1and RsN2had less observed species (decreased by 6%-11%) and Chao 1 index (decreased by 13%-15%), however, GlcN1and GlcN2enhanced α-diversity to some extent relative to Glc alone. PCoA showed that diazotroph community structure was clustered into different groups depending upon C sources, and was marginally affected by N inputs.was the most abundant genus in all treatments, and its relative abundance was significantly reduced by C and N addition in comparison with CK, however, the magnitude of reduction was obviously less in Rs-included treatments than in Glc-included treatments (12.3%-19.7%31.6%-40.5%). In contrasting to, the relative abundance of the second most dominant genus () was markedly increased by C addition relative to the CK, with greater magnitude observed in Glc-includedRs-included treatments (by 170%-270% vs. 25.0%-54.6%, respectively). Meanwhile, Multivariate regression tree analysis, RDA, and Mantel analysis revealed that the diazotroph abundance, diversity and community structurewere closely associated with soil NO3?-N and available P concentrations. 【】The results suggested that effects of N supply on soil diazotroph abundance, diversity and structure were regulated by C sources or the C availability of rice straw and glucose amendments. Meanwhile, the resulted differences of soil available P availability by various C additions might be a key driving factor of reshaping soil diazotroph community during Chinese milk vetch growth.

soil diazotroph; rice straw; glucose; nitrogen; Chinese milk vetch;

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.010

2019-04-19；

2019-05-29

國家綠肥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-22）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃（Grant Ref: BB/N013484/1）

楊璐，E-mail：luckyyl_520@163.com。通信作者曹衛(wèi)東，E-mail：caoweidong@caas.cn，caoweidongnj@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）