基于代謝組學的‘云抗10號’曬青茶加工過程代謝物變化

戴宇樵，呂才有，何魯南，易超，劉學艷，黃雯，陳加敏

基于代謝組學的‘云抗10號’曬青茶加工過程代謝物變化

戴宇樵1,2，呂才有1，何魯南1，易超1，劉學艷1，黃雯1，陳加敏1

（1云南農業大學龍潤普洱茶學院，昆明 650201；2貴州省茶葉研究所，貴陽 550006）

【】基于代謝組學的超高相液相色譜/質譜（LC-MS）聯用技術探究云南大葉種‘云抗10號’曬青茶加工過程中代謝產物的變化，發現影響曬青茶品質形成的標志性代謝物，并進一步研究這些物質的變化路徑，為了解云南曬青茶品質形成機理奠定基礎。在制作‘云抗10號’曬青茶過程中，取‘云抗10號’鮮葉、揉捻葉、曬青葉各3組。樣品經預處理后，運用LC-MS檢測3組樣品中的代謝產物，利用質譜數據庫對其定性。運用多元統計方法主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對3組樣品檢測數據進行分析。通過PLS-DA方法篩選差異顯著的代謝物。建立了‘云抗10號’鮮葉、揉捻葉和曬青葉的代謝物譜的LC/MS分析方法，將代謝組數據進行主成分分析和偏最小二乘法判別分析，并將3組樣品聚類區分。并用LC-MS技術對‘云抗10號’曬青茶及在制茶進行檢測，結合多元統計分析，在鮮葉、揉捻葉、曬青葉之間發現差異代謝物701種，揉捻葉與鮮葉的差異顯著代謝物116種，曬青葉與鮮葉的差異顯著代謝物158種，曬青葉與揉捻葉的差異顯著代謝物48種。比對KEGG與MWDB數據庫分析代謝物，這些代謝物主要與氨基酸及其衍生物代謝、多酚物質代謝等代謝途徑有關。利用LC-MS技術可以有效地對鮮葉組、揉捻葉組與曬青葉組進行區分，證明代謝組學技術在一定程度上可以揭示曬青毛茶在加工過程中內含代謝物的化學變化規律。研究發現的曬青毛茶品質形成關鍵代謝物，可為曬青品質的評價指標體系建立提供理論依據。

LC-MS；曬青茶；云抗10號；代謝組學；代謝物

0 引言

【研究意義】普洱茶的原料是云南大葉種曬青茶[1]。曬青毛茶是將云南大葉種茶樹鮮葉經過攤放、殺青、揉捻、日曬干燥制成的初加工茶，其中“日曬”這一過程對曬青茶獨特品質特征的形成至關重要。傳統工藝的重要性不能只是體現在普洱茶成品的風味上，還需要從更深度的機理方面去探究，了解云南大葉種曬青毛茶在曬青過程中內含物質的變化，是探索曬青茶品質形成的重要途徑。【前人研究進展】隨著飲茶的生活習慣在人們日常生活中越來越普及，消費者對茶葉的食品安全與品質要求逐漸提高。隨著科學檢測技術的進步，檢測茶葉各方面指標的方法也開始增多，從而能更好地提高茶葉品質。植物代謝組學指在特定的生理時間內，對某一植物組織或細胞的所有低分子量的代謝產物進行定性定量分析[2]。目前已有的代謝組學分析技術主要為氣相色譜質譜聯用、高效液相色譜質譜聯用、核磁共振、毛細血管電泳技術等。代謝組學技術已被廣泛應用于茶產業的多個環節中，可以用來更全面地了解茶葉從種植、加工、飲用過程中內含物質的變化規律，從而揭示茶葉特殊風味的形成原理。茶葉加工對茶葉品質形成來說是一項重要環節，但要探索茶葉生產工藝與品質的關系，常規檢測還不夠全面與深入。利用代謝組學技術可以進一步探索茶葉加工過程中的物質變化。研究證明，運用近紅外光譜分析方法對武夷巖茶生產過程中的實際在線檢測應用是可行的[3]。并且代謝組學技術能較全面地探究茶葉中特殊內含物變化規律，如花青素、生物胺的變化規律[4-7]。運用LC-MS可對普洱茶的風味化合物、抗氧化活性以及儲存年份進行鑒定[8-10]，也可通過對白茶內含物的鑒定對白茶品質進行分級[11-12]。通過研究不同山頭普洱生茶的差異代謝物，運用1H-NMR方法為普洱茶的品質評價找到新思路[13]。目前，HPLC、NMR等方法都能進行快速準確且具有深度的茶葉內含物質測定[14-17]。GC-MS是目前最準確、最全面的茶葉香氣檢測方法。試驗證明HS-SPME/GC-MS技術能較好地鑒定茶葉中的揮發性風味物質[18]。【本研究切入點】云南大葉種‘云抗10號’是云南省農業科學院茶葉研究所用單株育種法得到的品種，屬于喬木型茶樹[19]，具有產量高、品質優、抗逆性強、適應性廣的特點，是云南省茶產業的主力軍[20]，常用來制作云南綠毛茶、紅茶等，用該品種制作成的曬青毛茶品質具有一定的代表性。目前，關于普洱茶原料云南大葉種曬青茶的各方面研究都相對較少，探究曬青茶品質形成原因的研究更加薄弱。【擬解決的關鍵問題】以LC-MS為研究手段，選取具有代表性的云南大葉種‘云抗10號’作為原料，探究從鮮葉采摘到曬青茶制成過程中內含成分的變化規律，為曬青茶的品質形成機理與優化普洱茶加工工藝與品質提供參考。

1 材料與方法

試驗于2018年11—12月在云南農業大學龍潤普洱茶學院加工實驗室進行。

1.1 試驗材料與儀器

試劑：乙醇、甲醇、乙腈（Mecrk）標準品：二甲基亞砜（DMSO）或甲醇作為溶劑溶解后，-20℃保存，質譜分析前用70%甲醇稀釋成合適濃度（BioBioPha，Sigma-Aldrich），均為色譜純。

儀器：離心機（5424R 2 Eppendorf）（艾本德中國有限公司），真空冷凍干燥機（Labconco Freezone 2.5L-84），研磨機（MM 400，Retsch（德國RETSCH）），電炒鍋（6CCH-63型，富陽市葉峰茶葉機械設備），超高效液相色譜（UPLC）（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯質譜（MS/MS）（Applied Biosystems 6500 QTRAP）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制作

地點：云南普洱茶樹良種場

流程：鮮葉（一芽二葉（55%）、一芽三葉（45%））攤青、殺青、手工揉捻、日光干燥。

1.2.2 樣品預處理 選取‘云抗10號’加工過程中鮮葉（YK10-1）、揉捻葉（YK10-2）、曬青葉（YK10-3）各3份；樣品真空冷凍干燥；研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱100 mg粉末溶于1.0 mL的提取液中；保存于4℃冰箱，過夜，渦旋3次提高提取率；離心（轉速10 000×，10 min）后，取上清液，微孔濾膜（0.22 μm）過濾，然后進行LC-MS/MS分析。

1.2.3 LC-MS分析條件

超高效液相色譜（UPLC）和串聯質譜（MS/MS）。

液相條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18；流動相：水相，超純水（加入0.04%乙酸），有機相，乙腈（加入0.04%乙酸）；洗脫梯度：0 min為水/乙腈（95﹕5（V/V）），11.0 min為5﹕95（V/V），12.0 min為5﹕95 V/V，12.1 min為95﹕5 V/V，15.0 min為95﹕5 V/V；流速0.4 mL?min-1；柱溫40℃；進樣量2 μL。

質譜條件主要包括：電噴霧離子源，溫度500℃，質譜電壓5 500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導電離，參數設置為高。在三重四級桿中，每個離子對根據優化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行掃描檢測[21]。

1.2.4 數據分析 采用多元統計分析，基于OPLS-DA結果，從多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）中初步篩選出不同樣品間差異代謝物，再通過組合單變量分析的值或差異倍數值來進一步篩選差異代謝物。本試驗中存在生物學重復，通過fold change和OPLS-DA模型的VIP值相結合的方法來篩選差異代謝物。篩選標準：選取fold change≥2（上調）和fold change≤0.5（下調）的代謝物。在上述基礎上，選取VIP≥1的代謝物，VIP值表示對應代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，一般認為VIP≥1的代謝物為差異顯著。基于商業數據庫MWDB（metware database）及代謝物信息公共數據庫，利用三重四級桿質譜的多反應監測模式（MRM）分析完成代謝物定性。在獲得不同樣品的代謝物質譜數據后，對所有物質的質譜峰進行峰面積積分，并對不同樣品的相同代謝物質譜進行積分校正[22]。

2 結果

2.1 主成分分析

通過對樣本（包括質控樣品）的主成分分析，初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小[23]。其中MIX即上方提到的質控樣本，PCA得分圖如下（圖1）。在PCA圖中，圖上任意一點表示一個對應樣本。從圖中可以看出LC-MS分析所得原始數據在PC1、PC2兩種主成分中得到良好地呈現。在圖中，第一主成分的貢獻率為31.36%，第二主成分的貢獻率為29.19%，兩種主成分的貢獻率和為60.55%，代表兩個主成分能夠基本反映茶樣的主要特征信息。同時各組樣品與質控樣品質譜數據的PCA得分圖在圖上可見（圖2），左圖為不同主成分累計比例圖，右圖為不同主成分方差比例，每一點代表PC1至PC5，在左圖中，PC1對應點與右圖PC1對應點一致，PC2對應點縱坐標值為右圖中PC1貢獻率與PC2貢獻率之和，PC3對應點縱坐標值為右圖中PC1、PC2、PC3貢獻率之和，以此類推，左圖中PC5對應縱坐標值越接近于1，表示該PCA模型越具有可靠性，右圖中可看出主成分貢獻率比較為PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，由此也說明選取PC1、PC2來分析樣本具有較好可靠性。從3組樣品的聚類熱圖分析（圖3）上看出，3組樣本區別明顯，組內平行樣本成分接近，證明樣本的可靠性。

為了鑒別出具體有哪些差異代謝物造成了分離現象，建立‘云抗10號’鮮葉與揉捻葉之間、鮮葉與曬青葉之間、揉捻葉與曬青葉之間的3組PLS-DA模型。模型S圖如圖4所示，S圖能表示每個代謝物對于分組的貢獻率。橫坐標為可變量，數據離原點越遠，該點對樣品的組間分離貢獻越大；縱坐標為樣本之間的相關性，數據離原點越遠，樣本間的相關性越好。表1為模型評價參數，在這3組模型中，其中兩組R2Y和Q2的值均大于0.9（表1），其余一組R2Y與Q2值均大于0.3，說明這3組模型構建良好，預測性可靠。

圖1 各組樣品與質控樣品質譜數據的PCA得分圖

圖2 分組主成分分析可解釋變異圖

圖3 樣品總體聚類圖

表1 PLS分析的參數

2.2 差異代謝物篩選

通過PLS-DA分析后，根據VIP值＞1與上調代謝物fold change≥2和下調代謝物fold change≤0.5以及T檢驗的相對變量分析結果篩選出顯著差異代謝物。在‘云抗10號’曬青茶的加工中，將其鮮葉、揉捻葉、曬青葉進行分組，由圖5—7可看出鮮葉與揉捻葉差異代謝物116種、鮮葉與曬青葉差異代謝物158種，揉捻葉與曬青葉差異代謝物42種。統計出這3組對比的總差異代謝物180種，對總差異代謝物差異倍數值（FC）進行歸一化處理，從圖8中可以看出3組對比FC值部分區分良好，差異代謝物種類區別明顯。從表2可看出，總差異代謝物的物質種類與相對含量變化情況。在3組對比中均為差異代謝物的物質有8種，分別有上調差異代謝物異櫻花亭，5-尿嘧啶核苷酸（5-UMP），6-C-己糖基-金圣草黃素O-己糖苷、7-甲基鳥嘌呤、白楊素C-己糖苷，磷脂酰膽堿酰基16﹕1/14﹕1，咖啡醛在揉捻過程中相對含量下降，可在曬青過程中顯著上升，最終的變化趨勢表現為上升，下調差異顯著代謝物有萜類物質植保素D，黃酮碳糖苷物質C-己糖苷-異鼠李素O-己糖苷。

2.3 茶葉中特殊成分的變化規律

茶葉中有效活性成分種類豐富，本研究主要探討兒茶素類、黃酮類、氨基酸、生物堿類物質的相對含量變化規律。兒茶素類是茶葉中重要的活性物質，在本次檢測中，所有的兒茶素類物質從鮮葉到曬青葉的變化規律如表3所示，共檢測到兒茶素類14種，其中有71%呈下調趨勢，其余呈上調趨勢。且酯型兒茶素含量都呈顯著下降的。

圖中紅色表示VIP≥1的代謝物，綠色表示VIP＜1的代謝物

對于黃酮與黃酮醇物質，選取其中曬青葉與鮮葉相對比VIP≥1的黃酮類差異代謝物，列出3組樣品中含量變化。從表4可以看出，槲皮素，山奈酚、丁香亭、白楊素等物質的含量整體上呈大幅度增加趨勢，在差異顯著的黃酮類代謝物中僅有異鼠李素-3--新橙皮糖苷與芹菜素7--新橘皮糖苷（野漆樹苷）呈下調模式。

對于氨基酸及其衍生物類，選取其中曬青葉與鮮葉相對比VIP≥1的氨基酸類差異代謝物，列出3組樣品中的含量變化，從表5中可以看出茶葉中含有多種氨基酸，其中鮮葉中含量最多的是茶氨酸，本研究中檢測到茶氨酸隨著加工過程的進行其含量顯著下降。本研究共檢測到8種生物堿物質，且影響茶葉風味的關鍵代謝物咖啡堿相對含量呈下調趨勢（表6）。

3 討論

本研究中，兒茶素類從鮮葉到曬青葉明顯下降，可能是因為兒茶素性質不穩定，容易被多酚氧化酶氧化。當鮮葉經過攤青后，在失水與殺青的高溫作用下，其中的兒茶素可轉變為它對應的旋光異構體或順反異構體[24]。兒茶素還可以發生聚合反應形成原花青素與花青素，這兩種物質在本次反應中也被檢測到。同時，兒茶素類物質還可以與其他活潑的化合物（如多酚類物質、維生素、茶氨酸等）發生聚合反應。茶氨酸含量也發生了顯著下降，原因也可能是參與上述聚合反應形成的。而咖啡酰原兒茶酸、原兒茶醛、4-甲基兒茶酚、二沒食子兒茶素這4種上調物質，有可能是由于兒茶素內部發生了聚合反應，導致其中的咖啡酰原兒茶酸的含量明顯提升。也可能是與最終曬青過程中日光催化茶葉中的活性成分發生了反應，并且下調代謝物（ECG、EGCG與三兒茶素）含量在揉捻葉中含量最多，在曬青葉中含量又降低，表明這些物質在從鮮葉到揉捻葉的過程中遭到高溫的破壞，又在揉捻過程中反應增多，最后在日光催化下轉變為其他物質。

圖中一個點表示一種代謝物，橫坐標為代謝物在兩樣品中定量差異倍數對數值，縱坐標為VIP值。綠點為下調差異表達代謝物，紅點為上調差異表達代謝物，灰色部分為檢測到但差異不顯著的代謝物。下同

圖6 YK10-1_vs_YK10-3差異代謝物火山圖

圖7 YK10-2_vs_YK10-3差異代謝物火山圖

圖8 3組處理對比FC值聚類熱圖

表2 差異代謝物種類與變化情況

表3 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間兒茶素類代謝物差異

表4 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間黃酮與黃酮醇類代謝物差異

表5 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間氨基酸及其衍生物類代謝物差異

表6 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間生物堿代謝物差異

本研究中部分黃酮類物質在‘云抗10號’鮮葉中含量相對較低，然而經過高溫殺青后，黃酮苷遇熱發生水解，苷類配基脫去，轉化黃酮或黃酮醇，可使苷類物質的苦味降低[24]，這可能也是部分黃酮類物質上調的原因。然而在光的作用下黃酮也會分解，也就造成了部分黃酮含量的下降。

茶氨酸從鮮葉到揉捻葉表現為上升，然而從揉捻葉到曬青葉其含量表現為下降，總趨勢為上調，但其中下降這一表現與前人研究的氨基酸變化規律相符[25]。在殺青過程中，大量葉綠素遇熱導致大量葉綠素蛋白降解，形成大量游離氨基酸[26]。在曬青過程中，茶氨酸含量顯著降低可能是因為茶氨酸在日曬作用下易降解為谷氨酸和乙酰胺，同時茶氨酸被酶氧化，與兒茶素形成茶色素，但總體趨勢的上升或許是因為茶氨酸的耐熱耐酸性，使其在高溫殺青與機械作用中未被破壞。對于遞減的氨基酸或許是因為在高溫殺青的過程中，氨基酸類與碳水化合物發生美拉德反應生成黑色素并產生特殊的香味。其余大部分氨基酸相對含量均表現出遞增，包括γ-氨基丁酸。由此可見，在曬青茶中，茶葉中氨基酸類物質大部分被很好的保留下來，使曬青茶具有獨特鮮爽的滋味與良好的保健功效。

本研究共檢測到8種生物堿物質，其中甜菜堿相對含量最高，甜菜堿的學名為三甲基甘氨酸，參與滲透調節，與植物抗逆性相關，且外用具有護膚功效[27]。前人研究主要關注的咖啡堿、茶葉堿、可可堿也被檢測出，咖啡堿相對含量在鮮葉到揉捻葉再到曬青葉的加工過程中相對含量均下降，這與前人的研究結果相符[28]。咖啡堿具有苦味，且在后期加工過程中可與茶黃素以氫鍵締合形成具有鮮爽味的復合物[24]，可可堿相對含量在兩個品種中也均表現為下降，茶葉堿相對含量卻在曬青過程中增多并高于鮮葉中的含量。在今后的研究工作中，將進一步找到多種關鍵物質的變化途徑，研究其他品種曬青茶加工過程中的成分變化，與工藝相結合，探討加工過程中部分重要成分的轉化產物，更加深入地掌握曬青毛茶品質形成的機理。

4 結論

本研究運用超高效液相色譜和質譜聯用的方法，對云南大葉種‘云抗10號’曬青毛茶及其制茶過程中的代謝物進行了分析，發現此品種曬青茶在制作過程中內含成分產生顯著變化，且檢測到在平時茶葉研究中關注較少的物質相對含量變化十分顯著，如核苷酸及其衍生物、維生素、脂質、苯甲酸衍生物等多種代謝物。這表明在曬青毛茶加工中的攤青、殺青、揉捻、日光干燥過程中，除了兒茶素、黃酮類與氨基酸以及衍生物與生物堿發生較大變化外，許多其他代謝物也受到高溫、氧化、物理機械等作用而發生反應。

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Metabolic Changes in the Processing of Yunkang 10 Sun-Dried Green Tea based on Metabolomics

DAI YuQiao1,2, Lü CaiYou1, HE LuNan1, YI Chao1, LIU XueYan1, HUANG Wen1, CHEN JiaMin1

(1College of Long Run Pu-erh Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;2Guizhou Tea Institute, Guiyang 550006)

【】The ultrahigh phase liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS) combined technique of metabolomics was used to explore the changes of metabolites in the processing of sun-dried green tea ofcv. Yunkang 10, and to find the iconic metabolites affecting the formation of sun-dried green tea quality. Further study on the change path of these substances would lay a foundation for understanding the formation mechanism of sun-dried green tea quality. 【】In the process of making Yunkang 10 sun-dried green tea, 3 samples of fresh leaves, rolled leaves and sun-dried leaves were taken respectively. After the samples were pretreated, the metabolites in the three groups of samples were detected by LC-MS and identified by mass spectrometry database. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) were used to analyze the detection data of three groups of samples. Metabolites with significant differences were screened out by PLS-DA method. 【】LC-MS analysis method for the endogenous metabolites of Yunkang 10 fresh leaves, rolled leaves and sun-dried leaves was established, and commercial mass spectrometry database was used for rapid identification of the detected metabolites. The metabolome data were imported into SIMCA-P software for principal component analysis and partial least squares discriminant analysis, and the metabolome data could be used to distinguish the three groups of samples. By LC/MS technique on Yunkang 10 sun-dried green tea and its processing tea, in combination with multivariate statistical analysis, there were 701 kinds of metabolites were significant differences among the fresh leaves, rolling leaves and sun-dried leaves, and 116 kinds metabolites between fresh leaves and rolling leaves, 158 kinds of metabolites between sun-dried leaves and fresh leaves, and 48 kinds of metabolites between sun-dried leaves and rolling leaves were found. By searching KEGG database to analyze metabolites, these metabolites were mainly related to amino acid metabolism, polyphenol metabolism and other energy metabolism pathways. 【】LC-MS technique could be used to distinguish fresh leaf group, rolled leaf group and sun-dried leaf group of Yunkang 10, which proved that metabolomics technology could reveal the chemical changes of metabolites in sun-dried green tea to some extent. The key metabolites were found in the study could provide a theoretical basis for evaluating the quality of sun-dried green tea, and lay a theoretical foundation for exploring the formation of "sunburn taste" of sun-dried green tea and the formation mechanism of sun-dried green tea quality.

liquid chromatography/mass spectrometry; sun-dried green tea; Yunkang 10; metabolomics; metabolites

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.010

2019-04-18；

2019-10-09

國家現代農業茶葉產業體系專項資金資助（CARS-19）

戴宇樵，18985575397；E-mail：827927867@qq.com。通信作者呂才有，E-mail：2495846526@qq.com

（責任編輯 趙伶俐）