GRI2B基因多態(tài)性與閩南地區(qū)漢族人群癲癇的相關(guān)性研究

連霞 鄭麗群 錢小容 趙佳麗 費燕

中圖分類號 Q343.1+2：R742.1

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（ 2020）03-0348-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.19

摘要 目的：探討N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基基因GRIN2B多態(tài)性與閩南地區(qū)漢族人群癲癇的相關(guān)性。方法：采用回顧性研究方法，選取2017年1月-2018年5月在廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院進行體檢的167例健康人員為對照組，監(jiān)測過丙戊酸鈉血藥濃度的163例癲癇患者為癲癇組，采集兩組受試者的臨床資料及外周血。對受試者GRIN2B基因rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664、rs1805476、rs1806201、rs1805522、rs3764030、rs1019385等12個位點進行基因分型。采用Haploview 4.2軟件進行連鎖不平衡（LD）分析;采用Pearson相關(guān)性分析進行單倍型分析;采用基因型檢驗（GE-NO）、趨勢X2檢驗（TREND）、顯性基因檢驗（DOM）和隱性基因檢驗（REC）統(tǒng)計兩組受試者GRIN2B基因12個位點的野生純合子（AA）、突變雜合子（Aa）及突變純合子（aa）基因型的分布差異;采用Logistic回歸模型分析GRIN2B基因12個位點的致癲癇相關(guān)性。結(jié)果：兩組受試者GRIN2B基因12個位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P> 0.05）;由rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664組成的結(jié)構(gòu)域1（Blockl）和由rs3764030、rs1019385組成的Block2各位點之間存在明顯LD現(xiàn)象（D>0.9，r2>1/3）.blockl中的CGGACAG單倍體與癲癇的發(fā)生存在相關(guān)性（P<0.05）;rs74816802、rs2193149位點在兩組間分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;rs2193149位點突變可能有致癲癇作用（等位基因的加和作用：OR=1.529，L95=1.017，P=0.041）。結(jié)論：GRIN2B基因rs2193149位點突變可能是閩南地區(qū)漢族人群癲癇致病的相關(guān)危險因素之一。關(guān)鍵詞N-甲基-D-天冬氨酸;GRIN2B;基因多態(tài)性;癲癇;相關(guān)性

癲癇是神經(jīng)細胞異常放電導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。N-甲基-D-天冬氨酸（Ⅳ-methyl-D-aspartate，NMDA）受體是廣泛存在于大腦神經(jīng)元細胞中的興奮性谷氨酸受體，參與調(diào)節(jié)興奮性突觸傳遞，在腦發(fā)育、回路形成、細胞遷移和分化、突觸重塑等方面發(fā)揮重要作用[2]。有研究表明，NMDA受體GRIN2B亞基過度激活是癲癇發(fā)作的一個重要原因[3-4]。但經(jīng)檢索未發(fā)現(xiàn)NMDA受體GRIN2B亞基基因與癲癇相關(guān)性的報道。本研究擬采用病例對照研究探討NMDA受體GRIN2B亞基的12個位點基因多態(tài)性與癲癇的遺傳易感相關(guān)性。

l 研究對象

采用回顧性研究方法，選取來廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院就診的閩南地區(qū)漢族人，年齡18～60歲，其中進行體檢的167例健康人員為對照組，監(jiān)測過丙戊酸鈉血藥濃度的163例癲癇患者為癲癇組。癲癇患者入選標準：（1）按照國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）對癲癇發(fā)作及癲癇綜合征的分類標準[5]診斷為癲癇;（2）經(jīng)腦電圖證實為癲癇;（3）病程≥6個月。排除標準：（1）外傷性癲癇;（2）有精神障礙或情感障礙等依從性差的患者;（3）有嚴重心、肺、肝、腎等功能障礙;（4）有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤或變性疾病;（5）腦卒中或者顱內(nèi)感染所致癲癇;（6）有藥物濫用和酒精依賴患者。對照組的167例受試者中，男性83例、女性84例，年齡（38.6±19.2）歲，體質(zhì)量指數(shù)（23.58±1.26） kg/m2;癲癇組的163例受試者中，男性89例、女性74例，年齡（40.3±15.9）歲，體質(zhì)量指數(shù)（22.68±1.53）kg/m₂。兩組受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，患者本人或監(jiān)護人均簽署知情同意書。

2 方法

2.1 患者DNA提取

收集兩組受試者的靜脈血2mL，一周內(nèi)采用美國Omega核酸提取試劑盒進行DNA提取與純化，光密度（OD值）檢測及1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后將DNA轉(zhuǎn)移至96孔板，-80℃保存?zhèn)溆茫糜诤竺娴幕蚍中偷葯z測。

2.2 基因位點的選擇及引物設(shè)計

在國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（The National Cen-ter for Biotechnology Information，NCBI; https：//www.nc-bi.nlm.nih.gov/）中查找基因，在GeneView（ http：//bc3.m-formatik.hu-berlin.de/）中選擇該基因可能對蛋白質(zhì)水平產(chǎn)生影響的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，依據(jù)hapmap數(shù)據(jù)庫或1000 Genomes數(shù)據(jù)庫（http：//www.international-genome.org/），選取在中國漢族人群中最小等位基因頻率（MAF）大于0.05，且等位基因?qū)Φ确植嫉腟NP位點，綜合PubMed（PubMed.cn）和Google（ http：//www.google.cn）文獻檢索，所選位點通過美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站（http：//snpinfo.niehs.Nih.gov/）上的相關(guān)功能進行預(yù)測，信息核實后篩選出易感性的SNP位點。結(jié)果篩選出與GRIN2B基因相關(guān)的12個SNP位點，包括rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664、rs18 05476、rs1806201、 rs18 05522、rs3764030.rs1019385。采用Assay Designer 3.1軟件進行引物設(shè)計，包括上游引物、下游引物及延伸引物。GRIN2B基因12個位點的引物序列見表l。

2.3 基因分型

取“2.1”項下提取的DNA，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增出含有待檢SNP位點的目的片段，然后用蝦堿性磷酸酶（SAP）去除PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物，再加入單堿基延伸引物，其3'末端堿基緊挨SNP位點，且與目的片段上的堿基完全互補，采用4種ddNTP替代dNTP，這樣，探針在SNP位點處僅延伸一個堿基，連接上的ddNTP與SNP位點的等位基因?qū)?yīng)。用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測延伸產(chǎn)物與未延伸引物間的分子量差異，確定該點處堿基，進而進行SNP分型。參考文獻[6]設(shè)置單堿基延伸反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30s;94℃變性5s.52℃退火5s，80℃延伸5s，40個循環(huán)，其中每個循環(huán)中52℃退火和80℃延伸再進行5個循環(huán);最后72℃延伸3min。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Sequenom MassArray飛行時間質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)，以x₂檢驗將對照組和癲癇組受試者GRIN2B基因12個SNP位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，比較觀察值與預(yù)測值的差異，P>0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。采用Haploview 4.2軟件對12個SNP位點進行連鎖不平衡（LD）分析，即在某一群體中，不同座位上某兩個等位基因出現(xiàn)在同一條單體型上的頻率與預(yù)期的隨機頻率之間存在明顯差異的現(xiàn)象。當D>0.9且r₂>1/3，則視為存在LD現(xiàn)象。采用Pearson相關(guān)性分析進行單倍體分析，用假陽性發(fā)現(xiàn)率（FDR）法進行多位點數(shù)據(jù)分析校正多重檢驗。采用SPSS 21.0和Plink l.07軟件進行統(tǒng)計，組間基線數(shù)據(jù)中的連續(xù)變量符合正態(tài)分布，采用f檢驗，有序分類變量分析和兩組間基因頻率的比較采用X2檢驗。采用基因型檢驗（GENO）、趨勢x₂檢驗（TREND）、顯性基因檢驗（DOM）和隱性基因檢驗（REC）分析兩組受試者GRIN2B基因的12個SNP位點野生純合子（AA）、突變雜合子（Aa）及突變純合子（aa）的基因型分布。校正年齡和性別后，構(gòu)建攜帶GRIN2B等位基因與病例對照的Logistic回歸模型，采用f檢驗，檢測項目包括基因的加性效應(yīng)（ADD）和基因顯性效應(yīng)（DOMDEV）。L95、U95代表預(yù)測值95%置信區(qū)間（CI），當優(yōu)勢比（0R）>1且L95>1時，表示該等位基因確實有致病作用;當OR<1且U95 <1時，表示該等位基因有保護作用;當OR-1時，表示該位點與疾病無任何關(guān)系。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果

本研究中GRIN2B基因的12個SNP位點基因型觀察值與預(yù)測值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），各位點均符合Hardy-Weinberg平衡，表明該研究具有群體代表性。GRIN2B基因12個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡情況見表2。

3.2 LD和單倍體分析結(jié)果

由rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs748168-02、rs2160517、rs2193149、rs966664組成的區(qū)塊l（Blockl）和由rs3764030、rs1019385組成的Block2各位點之間存在明顯LD現(xiàn)象，其D>0.9且r₂>1/3。進一步比較發(fā)現(xiàn)，對照組與癲癇組比較P>0.05，提示LD與癲癇發(fā)病不相關(guān)。GRIN2B基因12個SNP位點的LD分析結(jié)果見圖1。

相鄰SNP的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代，位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點被稱作單體型。本研究的兩個區(qū)塊共構(gòu)建出9個單體型，癲癇組與對照組比較，Blockl中的CGGACAG單體型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明該單體型與癲癇的發(fā)生存在相關(guān)性。單倍體分析結(jié)果見表3。

3.3 基因型統(tǒng)計結(jié)果

TREND、DOM結(jié)果顯示，rs74816802位點在兩組受試者間的基因分布的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;GE—NO、TREND、DOM結(jié)果顯示，rs2193149位點在兩組受試者間的基因分布的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其余SNP位點的組間基因分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組受試者GRIN2B基因12個SNP位點基因型分布差異統(tǒng)計結(jié)果見表4。

3.4 Logistic回歸分析結(jié)果

統(tǒng)計結(jié)果顯示，GRIN2B基因rs2193149位點ADD項目的OR-1.529.L95 -1.017，P-0.041，提示rs2193149位點突變可能有致癲癇作用。GRIN2B基因12個SNP位點的Logistic回歸分析結(jié)果見表5。

4 討論

NMDA受體是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達且參與神經(jīng)傳遞的離子型谷氨酸受體[7]。NMDA受體由其亞基GRIN1、GRIN2A、GRrN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B組裝為異四聚體結(jié)構(gòu)，功能性NMDA受體則由2個GRINl亞基和2個GRIN2亞基組成，或者由2個GRIN1亞基和1個GRIN2亞基、1個GRIN3亞基組成[8]。在哺乳動物大腦中GRrN2B充當谷氨酸受體激動劑結(jié)合位點和主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，NMDA受體被激活后，引起Ca₂₊內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca₂₊相關(guān)信號通路過度激活，導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電。癲癇的發(fā)生正是興奮性神經(jīng)元（NMDA電流）和抑制性神經(jīng)元[y-氨基丁酸（GABA）電流]異常放電的結(jié)果[9]。癲癇的致病因素復(fù)雜，癲癇的家族遺傳性被認為是癲癇發(fā)病的一個重要原因，從遺傳學(xué)角度考慮，已有研究發(fā)現(xiàn)GRIN2B基因rs7301328位點基因多態(tài)性與帕金森病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10];楊雅玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)在中國不伴癡呆的帕金森病人群中，GRIN2B基因rs7301328位點的GG基因型可能是帕金森病相關(guān)幻覺的保護因素。由此可見，研究受體通道基因多態(tài)性對于癲癇的治療具有重要的價值，可為癲癇患者的個體化治療提供理論依據(jù)。

已有研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體突變及罕見變異見于多種神經(jīng)精神疾病[12]。一項包含258個NMDA受體突變及罕見變異的研究結(jié)果顯示，49%的患者表現(xiàn)為癲癇;而GRIN2B/GluN2B變異患者主要表現(xiàn)為智力障礙（87%），其次是癲癇（29%）[11]。本研究通過對比閩南地區(qū)漢族癲癇患者與健康人員NMDA受體GRIN2B亞基基因多態(tài)性，探討GRIN2B基因多態(tài)性與癲癇的關(guān)聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者與健康人員的GRIN2B亞基基因rs74816802 .rs2193149位點基因型分布存在顯著差異（P<0.05），且Logistic回歸結(jié)果顯示rs2193149位點OR>1.L95>1，提示GRIN2B亞基基因rs2193149位點的突變可能與癲癇易感性相關(guān)。但由于本研究樣本量有限，主要為閩南地區(qū)漢族人，對課題的研究具有一定局限性。此外，癲癇發(fā)作類型多，存在多種綜合征，個體間臨床差異大，不同年齡致病因素不同，故對于GRIN2B基因位點多態(tài)性影響癲癇發(fā)生發(fā)展的確切分子機制尚有待進一步研究。

參考文獻

[1] ORTEGA-MORENO L，GIRALDEZ BG，SOTO-INSU-GA V，et al.Molecular diagnosis of patients with epilepsy and developmental delay using a customized panel of epi-lepsy genes[J]. PLoS One， 2017.DOI： 10.1371/journal.po- ne.0188978.

[2]HU C，CHEN W，MYERS SJ，et al.Human GRIN2B vari- ants in neurodevelopmental disorders[J].L，Pharmacol Sci， 2016，132（2）：115-121

[3]SCHIDLITZKI A，TWELE F，KLEE R，et al.A combina- tion of NMDA and AMPA receptor antagonists retards granule cell dispersion and epileptogenesis in a model of acquired epilepsy[J]. Sci Rep， 2017，7（1）：1 2191-1 2210.

[4]ADDIS L.VIRDEE JK，VIDLER LR，et al Epilepsy-asso- ciated GRIN2A mutations reduce NMDA receptor traftick- ing and agonist potency-molecular protiling and function- al rescue[J]. Sci Rep，2017，7（1）：66-80

[5]BEGHI E，BERG A，CARPIO A，et al.Comment on epi- leptic seizures and epilepsy： definitions proposed by the International League Against Epilepsy （ILAE） and the In- ternational Bureau for Epilepsy（IBE） [J]. Epilepsia，2 005， 46（10）：1698-1699.

[6]林雪玉，張燕青，林鵬鋒，等UGTIA6.UGTIA9基因多 態(tài)性對漢族癲癇患者丙戊酸血藥濃度的影響[J].中國藥 厲，2017，28（8）：1013-1017

[7]HESS S，DAGGETT L，CRONA J，et al Cloning and func- tional characterization of human heteromeric N-methyl- D-aspartatereceptors[J].，Pharmacol Exp Ther，1996，278 （2）：808-816

[8] TRAYNELIS SF，WOLLMUTH LP，MCBAIN CJ，et al Glutamate receptor ion channels： structure， regulation， and function[J]. Pharmacol Rev，2010，62（3）：405-496.

[9]BERNARD-TRIFILO JA，KRAMAR EA，TORP R，et al Integrin signaling cascades are operational in adult hippo- campal synapses and modulate NMDA receptor physiolo- gy[J].I， Neurochem， 2005 ，93（4）：834-849.

[10]ZAINAL ABIDIN S，TAN EL，CHAN SC，et al. DRD and GRIN2B polymorphisms and their association with the de- velopment ofimpulse control behaviour among Malaysian Parkinson's disease patients[J]. BMC Neurology， 2015， 15 （1）：59-69

[11]楊雅玲，吳鋼，胡志堅，等中國人GRIN2B.SNCA基因多 態(tài)性與帕金森病相關(guān)幻覺的關(guān)聯(lián)分析[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾 病雜志，2018，35（3）：205-210.

[12]XIANGWEI W， JIANG Y，YUAN H. De novo mutations and rare variants occurring in NMDA receptors[J]. Cur- rent Opinionjn PhVsiology， 2018.DOI： 10.1016/j.cophys 2017.12.013.

（收稿日期：2019-09-18 修回日期：2019-12-16）

（編輯：鄒麗娟）