板栗STP家族基因鑒定與分析

程運河，程麗莉，曹慶昌，蘭彥平*

(1.北京市林業果樹科學研究院，北京 100093；2.國家林業局板栗工程技術研究中心，北京 100093)

【研究意義】板栗(Castaneamollissima)是原產于我國的重要闊葉經濟林，雌雄同株異花，且雌、雄花比例嚴重失衡(1∶2400～4∶500)[1]。根據形態發生順序，板栗花芽分化階段可分為：生理分化期、花序原基分化期、苞片原基分化期、花簇原基分化期和雄(雌)蕊原基分化期。目前研究認為營養和激素是影響板栗花芽性別分化的重要原因[2]。徐娟[3]和陳在新等[4]的研究表明，結果母枝中的蔗糖含量高于雄花枝。生產中常通過修剪、施肥等方式改善樹體營養，促進雌花分化，增加產量[5]。因此研究板栗的糖的分配對于調控板栗花芽性別分化、增加雌花比例具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】糖是主要的能量來源，也是重要的信號物質，廣泛參與植物的生長發育和脅迫響應[6-8]。高等植物中，碳水化合物由源組織-葉片通過光合作用產生后，被運輸到幼嫩葉片、根、花、果實等庫組織，為正常生命-活動和生長發育提供能量[9-10]。糖主要以蔗糖形式通過韌皮部從源組織運輸到庫組織[11]。蔗糖運輸到庫組織時先在細胞外被分解成單糖，再由STP(SUGAR TRANSPORT PROTEIN)蛋白將單糖提取到庫細胞中[12-13]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的STP1(SUGAR TRANSPORT PROTEIN 1)基因是植物中第一個被鑒定到的單糖轉運蛋白基因[14]。目前已在擬南芥基因組中鑒定到14個STP基因(STP1-14)，且這些基因均屬于MONOSACCHARIDE TRANSPORTER (MST)-like superfamily[15-16]。近年來，高粱(Sorghumbicolor)[17]、梨(PyrusbretschneideriRehd)[18]等植物中的STP基因也相繼被鑒定。STP基因的表達具有時空特異性。擬南芥中AtSTP8在配子體中均高表達。AtSTP12與內珠皮的發育和側根的發生有關。AtSTP1和AtSTP5則在種皮中表達[13, 19]。在擬南芥中，AtSTP3和AtSTP14主要在成熟葉片中表達[20-21]。此外，STPs的表達受其轉運底物、生物脅迫和非生物脅迫的影響[8, 13, 22]。不同的STP轉運單糖的種類和能力各異[16, 20-21]。STP蛋白轉運的單糖主要包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和甘露糖等[11, 23]。大多STP家族成員能夠轉運多種單糖。少數STP蛋白對單糖的轉運具有特異性。如木薯中的MeSTP4和MeSTP10只能轉運麥芽糖[11]。STP蛋白對糖的轉運是通過其跨膜結構域和疏水片段實現的[12, 24]。典型的STP蛋白均存在12個跨膜結構域[11, 13, 25]?？缒そY構域能將STP蛋白定位于細胞質膜上[24-25]。STP蛋白細胞質膜外側的均疏水片段能夠形成一個Lid區域，將糖和質子與質外體隔離，形成特殊的微環境，以實現糖的跨膜轉運[12]。隨著高通量測序技術的進步和成本的降低，基因組測序已在植物研究中廣泛應用。北京農學院秦嶺研究團隊基于二代和三代測序，完成了中國板栗基因組測序、組裝和注釋。該研究組裝的板栗基因組大小為785.53 Mb，Contig N50為944 Kb，能夠覆蓋96.7 %的基因組，注釋了36 479個基因。該基因組圖譜的繪制為板栗的進化起源、分子生物學研究和遺傳改良提供了重要的參考依據?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用生物信息學方法，在板栗基因組中鑒定STP家族成員，并對其基因結構、蛋白保守結構域、表達模式等進行分析?！緮M解決的關鍵問題】旨在提供板栗STP基本信息，解析STP的功能，為進一步研究STP家族成員在板栗花芽性別分化過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 板栗基因組STP家族成員的鑒定

首先在gigaScience網站下載板栗基因組數據。從Pfam網站下載STP蛋白保守domain的隱馬爾科夫(HMM)模型文件，標號為PF00083。利用HMM3.0軟件，基于隱馬爾科夫模型，在板栗基因組數據中搜索含有STP結構域的蛋白序列，閾值為E-value < e-10。將搜索到的蛋白序列放到NCBI網站，在CDD數據庫中尋找保守的STP結構域，閾值設為E-value < 0.01。

1.2 板栗STP家族基因結構、保守基序分析和進化分析

TBtools軟件用于CmSTP家族基因結構分析。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線網站，輸入CmSTP家族的氨基酸序列，搜索保守基序，參數設置為：基序的重復數“any”?；蜷L度6～200 aa，預測基序數量10個。將得到的保守基序在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網站進行功能注釋。從Phytozome數據庫下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、木薯(Manihotesculenta)的STP氨基酸序列，并將其與篩選到的板栗CmSTP氨基酸序列用Clustal W進行多重比對后導入MEGAX，用臨接法(NEIGHBOR-joining)構建進化樹，校驗參數為bootsrap=1000。

1.3 板栗STP家族蛋白理化特性分析

利用在線工具ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam)分析板栗STP家族成員的等電點、長度和分子量等屬性。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測CmSTP家族蛋白質二級結構。用Plant-mPLoc軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進行亞細胞定位預測。使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜結構域。

1.4 板栗STP家族基因表達模式分析

混合芽是板栗形成產量的基礎。檢測STP在板栗混合芽早期發育中的表達量，對于研究糖代謝與板栗花發育和產量形成具有重要意義。本研究利用北京市林業果樹科學研究院板栗研究室的前期研究中板栗不同時期混合花芽轉錄組數據，對板栗STP家族基因表達量進行分析。其取樣方法如下：以北京市密云縣板栗標準化栽培示范園10年生板栗優系‘YH-1’為材料，在春季萌動后，分別于2017年3月9日，2017年3月16日，2017年3月30日，2017年4月7日和2017年4月13日，取混合芽，進行轉錄組測序。設置3個生物學重復，每重復1株板栗。利用百邁客云平臺(http://www.biocloud.net/)從5個發育時期的RNASeq數據中提取CmSTP家族成員的表達量，并利用HemI1.0軟件繪制表達模式熱圖。

2 結果與分析

2.1 板栗STP基因鑒定

利用HMM3.0軟件，在板栗基因組數據庫中共搜索到17個STP家族成員(表1)。依據各基因在染色體上的位置信息，依次命名為CmSTP1～CmSTP17。CmSTP開放閱讀框長度范圍為843～1584 bp，其中CmSTP14開放閱讀框最短，為843 bp，CmSTP6開放閱讀框最長，為1584 bp。CmSTP蛋白分子量相對較大，介于32 122.5～57 788.3 kDa，等電點介于5.46(CmSTP3)～10.46(CmSTP17)，其中只有CmSTP3蛋白偏酸性，其余CmSTP成員蛋白均呈堿性或弱堿性。

表1 板栗CmSTP基因家族信息

2.2 板栗STP結構特征

2.2.1 板栗STP基因結構分析 在鑒定得到的17個CmSTP基因中，只有CmSTP17沒有內含子(圖1)。其余CmSTP基因中內含子數量介于1～4個。其中CmSTP14有1個內含子，CmSTP8、CmSTP9、CmSTP12均有2個內含子，CmSTP3內含子數量最多，為4個。CmSTP13、CmSTP6、CmSTP15和CmSTP8內含子的長度明顯長于其它CmSTP基因。

圖1 板栗STP家族基因結構Fig.1 The structure of STP gene family in Chinese chestnut

2.2.2 板栗STP蛋白保守基序分析 使用MEME軟件分析了CmSTP蛋白序列，共鑒定到10個保守基序：Motif1～Motif10(圖2)。將得到的Motif序列在Pfam網站注釋，結果顯示除Motif5沒有得到注釋信息外，其余Motif均為Sugar_tr家族(PF00083)結構域(表2)。17個CmSTP蛋白保守基序數量和類型不同。CmSTP14、CmSTP3和CmSTP17保守基序數量較少，分別只有5、6、7個Motif。CmSTP2、CmSTP8和CmSTP12均有9個Motif。在所有保守基序中，只有Motif1、Motif3和Motif5同時存在于17個CmSTP蛋白中。

表2 板栗STP蛋白保守基序注釋

圖2 板栗STP蛋白保守基序分布Fig.2 The prediction of conserved motifs in Chinese chestnut STP proteins

2.2.3 板栗STP蛋白二級結構分析 利用在線二級結構預測軟件SOPMA對板栗STP家族蛋白的二級結構進行分析(表3)。17個板栗STP蛋白二級結構均包含α-螺旋、延伸主鏈、無規則卷曲和β-轉角。其中α-螺旋比例最高，介于46.00 %～52.95 %，其次為無規則卷曲26.68 %～31.52 %，再者為延伸主鏈14.59 %～19.38 %，最低的是β-轉角3.44 %～5.86 %。

表3 板栗STP家族蛋白二級結構基本特征

2.2.4 板栗STP蛋白跨膜結構域及亞細胞定位預測 使用TMHMM在線工具預測板栗STP蛋白跨膜結構域(表4)。CmSTP1, CmSTP4-7，CmSTP9, CmSTP13跨膜結構域數量最多，為12個；CmSTP3, CmSTP14, CmSTP17的跨膜結構域較少，分別為5，6和8個。進一步對CmSTP蛋白N端和C端跨膜結構域進行統計，發現C端跨膜蛋白的數量較N端穩定。在C端，CmSTP3和CmSTP14的有2個跨膜結構域，CmSTP10和CmSTP16有5個跨膜結構域，其余13個CmSTP均有6個跨膜結構域。亞細胞定位預測結果顯示，所有CmSTP均定位于細胞膜(表4)。

表4 板栗STP蛋白跨膜結構域及亞細胞定位信息

2.3 板栗STP系統進化分析

利用17個板栗(Castaneamollissima)STP家族成員、20個木薯(Manihotesculenta)STP家族成員和14個擬南芥(Arabidopsisthaliana)STP家族成員的蛋白序列構建系統發育樹(表5)。52個STP蛋白聚為4個類群(Group I～Group IV，圖3)。類群I和類群II中以木薯STP蛋白為主，且均只包含2個CmSTP蛋白(Group I: CmSTP5和CmSTP6；Group II: CmSTP12和CmSTP15)。Group III的STP成員最多(19個)，以板栗STP成員為主(8個)，其次為擬南芥(6個)，木薯最少(5個)。類群IV中STP數量較少(9個)，其中板栗STP成員為5個，木薯STP成員為3個，擬南芥STP成員為2個。從整體來看，不同物種STP成員在類群中的分布具有差別。板栗STP家族成員主要分布在類群III和IV中，木薯STP家族成員主要分布在類群I，II和III中，而擬南芥STP家族成員主要分布在類群III和IV中。

表5 木薯和擬南芥CmSTP蛋白名稱及對應的基因登錄號

圖3 板栗(★)、木薯(●)和擬南芥(▲)STP蛋白系統進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of STP proteins from Chinese chestnut (★), Manihot esculenta (●) and Arabidopsis thaliana(▲)

2.4 板栗STP基因表達模式分析

對不同時期(S1：2017年3月9日，S2：2017年3月16日，S3：2017年3月30日，S4：2017年4月7日，S5：2017年4月13日)板栗混合芽轉錄組數據中CmSTP基因的表達量進行分析(圖4)，未檢測到CmSTP1，CmSTP3，CmSTP9，CmSTP11，CmSTP14和CmSTP17表達數據，說明該6個基因可能在混合芽中不表達。其余CmSTP基因中CmSTP6，CmSTP12和CmSTP15的表達量相對較高，并且高表達主要發生在混合芽發育的早期(S1，S2)。在S3期三者的表達量急劇降低，隨后維持在較低水平。CmSTP6的高表達由S1期持續到S2期，并且略有上升。而CmSTP12和CmSTP15的高表達主要發生在S1期，隨后其表達量逐漸降低。雖然CmSTP2，CmST8和CmSTP13的表達量相對較低，但與CmSTP6，CmSTP12和CmSTP15的表達量變化趨勢一致。

S1，2017年3月9日；S2，2017年3月16日；S3，2017年3月30日；S4，2017年4月7日；S5，2017年4月13日；S1, March 9, 2017; S2, March 16, 2017; S3, March 30, 2017; S4, April 7, 2017; S5, April 13, 2017

3 討 論

在板栗基因組數據中共鑒定到17個STP家族成員，與擬南芥(Arabidopsisthaliana, 14個)[16]、番茄(Solanumlycopersicum, 18個)[26]、木薯(Manihotesculenta, 20個)[11]中STP的數量相近。板栗中14個CmSTP蛋白氨基酸長度介于463～528(表1)，與其它物種的STP蛋白相近[11, 16, 26]。CmSTP3、CmSTP14和CmSTP17的氨基酸序列明顯短于其它CmSTP(表1)，但其C端均有保守的Sugar_tr家族(PF00083)結構域基序Motif1和Motif3(圖2)。注釋到的其它6個Sugar_tr家族結構域基序在N端和C端均有分布，但在CmSTP成員中存在不同程度的丟失，這與番茄[26]、甘藍[25]等物種上的研究結果一致。

17個CmSTP的亞細胞定位預測均位于細胞膜，符合STP蛋白從細胞外將單糖轉運到庫細胞的功能[27-28]。但各CmSTP蛋白跨膜結構域的數量不盡相同。板栗中含12個跨膜結構域的STP蛋白最多，有7個，占總CmSTP數量的41.2 %。其余CmSTP蛋白均有不同程度缺失，其中N端跨膜結構域的缺失較為嚴重與木薯中的研究一致[11]。在其它物種上的研究推測，N端保守結構域的丟失可能是STP進化的標志[24-25, 29]。這可能是CmSTP中最保守的Motif1和Motif3均位于C端的原因(圖2)。最近對擬南芥AtSTP13的研究證明，C端基序是STP蛋白細胞膜定位的核心結構域[24]。上述結果暗示，Motif1和Motif3可能是STP家族的核心結構域，在STP的細胞膜定位中發揮著關鍵作用。根據進化關系，板栗(Castaneamollissima)、木薯(Manihotesculenta)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的STP家族成員均可分成4組(圖3)。禾本科植物中STP也有相似的分類[29]，說明不同物種的STP在進化上具有相似性。

板栗轉錄組數據分析結果顯示，混合芽中CmSTP6、CmSTP12和CmSTP15表達較高，CmSTP2和CmSTP8次之，其他CmSTP表達量較低或不表達(圖4)。并且CmSTP6、CmSTP12、CmSTP15、CmSTP2和CmSTP8均在混合芽春季萌動期高表達，隨后逐漸降低，具有時空特異性(圖4)。STP基因的表達能夠調控碳水化合物代謝[6, 30-31]。在植物中，通?？蓪⒔M織的發育過程分為生理分化期和形態分化期。在早春，混合芽雖然未進行形態分化，但其內部的生理生化進程已經比較活躍，此時的混合芽處于生理分化期。CmSTP6、CmSTP12和CmSTP15在早春的高表達，暗示三者可能負責將樹體中貯藏的糖運輸到芽中，為新生組織的分化和發育提供能量和結構物質。值得注意的是CmSTP6的高表達持續到S2期，該時期是本研究材料 ‘YH-1’響應修剪、促進結果枝形成的臨界時期。在擬南芥中，與CmSTP6同源關系較近的AtSTP13與碳、氮代謝有關。AtSTP13能與AtCWIN1蛋白協同作用，將質外體的蔗糖分解成葡萄糖和果糖，并以sugar/H+共運輸的形式跨膜運輸到細胞內[31]。在擬南芥中過表達AtSTP13可提高植株氮素利用率，促進植株生長[19]。而蒿柳(Salixviminalis)中的研究表明，碳水化合物的代謝有利于雌花的分化[32]。蘋果中，扭捎可以增加尾梢的碳氮比，促進花芽形成，提高花芽比例[33]。上述結果暗示CmSTP6可能通過調控混合芽的碳氮比，參與板栗混合芽的早期發育，但其具體機制仍需進一步研究。STP的生物學功能具有多樣性，本研究提供了板栗STP家族基本信息，為后續CmSTP家族成員的功能驗證提供了參考。

4 結 論

本研究在板栗基因組數據庫中共篩選到17個STP家族成員。保守結構域分析表明，板栗STP家族成員中共有10個保守motif，其中Motif1，Motif3和Motif5保守程度最高，存在于所有板栗STP蛋白中，其余motif在板栗STP家族進化過程中存在不同程度的丟失。進化分析結果顯示，板栗與擬南芥、木薯的STP家族均可分為4類，板栗STP家族成員主要分布在Group III和Group IV中。板栗STP基因表達分析結果顯示，CmSTP6、CmSTP12和CmSTP15在混合芽萌動早期的表達量較高，而其它成員表達量較低或不表達，說明STP家族基因的表達可能具有組織特異性，參與不同的生物學進程。