炎癥微環境對人牙髓細胞向成牙本質細胞分化的影響

唐杰

炎癥微環境對人牙髓細胞向成牙本質細胞分化的影響

唐杰

（合肥市口腔醫院，安徽 合肥 230001）

通過體外培養人牙髓細胞，研究炎癥微環境對人牙髓細胞向成牙本質細胞分化的影響。用體外酶消化結合組織塊法培養人牙髓細胞。將細胞分為對照組和實驗組，對照組為正常培養液培養的人牙髓細胞，實驗組為含TNF-α終濃度分別為10 ng/ML培養液培養的人牙髓細胞，分別將兩組細胞進行成骨誘導；Real time PCR檢測成骨誘導后兩組細胞牙本質基質蛋白1（DMP1）、牙本質涎磷蛋白（DSPP）、骨鈣蛋白（OCN）的表達情況。酶消化加組織塊法培養出來的牙髓細胞大多呈長梭形，胞漿豐滿；Real time PCR檢測結果表明，與對照組相比，成骨誘導后，TNF-α刺激下的牙髓細胞DMP1、DSPP、OCN的mRNA表達量明顯降低，差異有統計學意義。實驗發現，炎癥微環境可以導致牙髓細胞向成牙本質細胞分化能力減弱，從而影響牙體組織的健康。

炎癥微環境；人牙髓細胞，成牙本質細胞；分化影響

人牙髓干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，具有較強的增殖和分化能力，在一定條件下可分化為成軟骨細胞、成牙本質細胞、成骨細胞以及脂肪細胞[1-2]，因此，牙髓干細胞作為一種牙髓再生的種子細胞[3]，對維系牙齒的健康有著重要的作用。炎性微環境是牙髓疾病最常發生的一種病理狀態，嚴重影響著牙齒的健康，本實驗對炎性微環境下人牙髓細胞向成牙本質細胞的分化過程進行了研究，探索了該分化過程中相關基因表達發生的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實驗儀器

主要試劑、實驗儀器如表1所示。

表1 主要試劑、實驗儀器

名稱公司生產地 PBSHyCIoneUSA α-MEM培養基GibcoUSA 胎牛血清四季青杭州 雙抗GibcoUSA Ⅰ型膠原酶SolarbioUSA 胰蛋白酶GibcoUSA TNF-αBioVisionUSA TRIzol裂解液AmbionCA 逆轉錄試劑盒TIANGEN北京 RT-PCR試劑盒TIANGEN北京 二氧化碳培養箱ThermoUSA 超凈培養臺蘇州設備凈化有限公司蘇州 倒置相差顯微鏡OLYMPUSJapan

1.2 實驗方法

1.2.1 取材

牙髓組織取材于合肥市口腔醫院口腔頜面外科門診因正畸拔除或第三磨牙拔除的患者，取材前征得患者及家屬同意，要求患者無全身系統性疾病，無牙體牙髓疾病及牙周疾病，患者年齡14～20歲。

1.2.2 細胞培養

酶消化結合組織塊法培養牙髓細胞，用無菌裂鉆劈開牙體硬組織，取出新鮮的牙髓組織放在預冷的含有雙抗的比例為1∶100的PBS中，反復沖洗干凈后轉移到無菌培養皿中用手術刀輕輕分割牙髓組織。1 000 r/min離心5 min。棄上清后，加入含3 mg/ml的I型膠原酶1 ml，37.5 ℃每隔5 min振蕩，消化70 min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入2 ml α-MEM培養液（含10%胎牛血清），將其置于二氧化碳培養箱（5 %CO2，37 ℃恒溫）中孵育，每隔一天換液。待細胞匯集80%后傳代培養。

1.3 實驗分組

將牙髓細胞分為正常組和實驗組，正常組細胞用含有5%胎牛血清的α-MEM培養液培養，實驗組細胞用培養液含終濃度為10 ng/ML的TNF-α培養，并對兩組細胞分別進行成骨誘導。

1.4 Real time PCR檢測兩組細胞成骨誘導前后DMP1、DSPP、OCN的表達

將正常組和對照組的牙髓細胞用TRIzol裂解，提取RNA，經逆轉錄為cDNA。引物設計由上海生工生物有限公司設計合成，引物序列如表2所示。

1.5 統計學分析

使用SPSS 22.0軟件進行統計分析，各實驗數據均采用均數±標準差（±）表示，組間差異單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。＜0.05，差異有統計學意義。

表2 引物序列

基因上游引物下游引物 DMP15’AGTGCCCAAGATACCACCAG3’ 5’CATTCCCTCATCGTCCAACT3’ DSPP5’TGGCGATGCAGGTCACAAT3’5’CCATTCCCACTAGGACTCCCA3’ OCN5’AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG 3’5’CCCTCCTGCTTGGACACAAAG3’ β-actin5’GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG3’5’CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3’

2 實驗結果

2.1 人牙髓細胞的培養

用酶消化+組織塊法培養原代細胞，3 d左右組織塊周圍有牙髓細胞貼壁爬出，原代培養的牙髓細胞如圖1所示。待細胞長到80%進行傳代，實驗選用細胞狀態良好的第三代細胞作為研究對象，第三代牙髓細胞如圖2所示。

圖1 原代培養的牙髓細胞

圖2 第三代牙髓細胞

2.2 成骨誘導后，炎癥微環境下牙髓細胞成牙本質相關基因表達情況

分別對正常培養液培養下的人牙髓細胞與TNF-α刺激下的人牙髓細胞進行成骨誘導，誘導3周后Real time PCR檢測各組細胞牙本質基質蛋白1（DMP1）、牙本質涎磷蛋白（DSPP）、骨鈣蛋白（OCN）的表達情況，結果顯示TNF-α刺激組DMP1、DSPP、OCN的表達明顯降低。成骨誘導后刺激組DMP1表達明顯下降如圖3所示，成骨誘導后刺激組DSPP表達明顯下降如圖4所示，成骨誘導后刺激組OCN表達明顯下降如圖5所示，圖3、圖4、圖5差異有統計學意義（＜0.05）。

3 討論

牙髓干細胞是從牙髓細胞中分離出來的一種具有干細胞特性的細胞，其作為種子細胞，在牙髓再生的過程中發揮著重要的作用。本實驗雖然提取的是牙髓細胞，但其骨向分化能力顯示其中包含了牙髓干細胞，炎癥微環境一方面影響了牙髓細胞的活力，另一方面在很大程度上影響了牙髓干細胞分化的功能。本實驗研究了炎癥狀態下人牙髓細胞向成牙本質細胞分化過程中相關基因表達的情況，發現成牙本質相關基因表達量的改變，從而證明了炎癥微環境會導致人牙髓干細胞成人本質分化能力減弱。

牙本質基質蛋白1（DMP1）是牙發育過程中一種重要的非膠原基質蛋白，在骨細胞中特異表達，對牙本質的形成和礦化起著重要作用，有學者研究表明[4]在分泌過程中，全長的前體Dmp1被裂解成N-和C-末端片段。C-末端Dmp1磷酸化，成為一個高度負電荷的結構域，可能通過吸收鈣離子和影響隨后的礦物質沉積來幫助骨礦化，DMP1在牙胚發育過程中具有誘導成牙本質細胞分化和分泌，啟動牙本質礦化和充當細胞間信號分子等作用[5]。牙本質涎磷蛋白（DSPP）是牙本質礦化研究領域中的熱點，研究表明DSPP基因突變與牙本質發育不全密切相關，并伴有明顯的牙齒齲壞[6-7]，有學者在小鼠中敲除了DSPP基因，研究發現小鼠的牙本質和骨礦化缺陷[8]。本實驗中通過檢測DMP1和DSPP這兩種與牙本質形成密切相關的兩個基因，同時檢測了與骨形成密不可分的基因OCN，在一定程度上反映了牙髓細胞向成牙本質細胞分化的能力，而炎癥微環境影響了該能力，阻礙了牙髓細胞向成牙本質細胞分化。

圖3 成骨誘導后刺激組DMP1表達明顯下降

圖4 成骨誘導后刺激組DSPP表達明顯下降

圖5 成骨誘導后刺激組OCN表達明顯下降

［1］NNTI N，CORALLO C，CHAN B M，et al.Multipotent differentiation of?human?dental pulp?stem cells：a literature review［J］.stem cell rev rep，2016，12（5）：511-523.

［2］GRONTHOS S，MANKANI M，BRAHIM J，et al.Postnatal?human?dental pulp?stem cells?（DPSCs） in vitro and in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（25）：13625.

［3］PIVA E，TARLE S A，NOR J E，et al.Dental pulp?tissue regeneration using?dental pulp?stem cells?isolated and expanded in?humanserum［J］.Journal of endodontics，2017，43（4）：568-574.

［4］OYA K，ISHIDA K，NISHIDA T，et al. Immunohistochemical analysis of dentin matrix protein 1（Dmp1） phosphorylation by Fam20C in bone：implications for the induction of biomineralization［J］.Histochem Cell Biol，2017，147（3）：341-351.

［5］LU Y，YE L，YU S，et al.Rescue of odontogenesis in?Dmp1-deficient mice by targeted re-expression of?Dmp1?reveals roles for?Dmp1?in early odontogenesis and?dentin?apposition in vivo［J］.Dev Biol，2007，303（1）：191-201.

［6］KIM J W，SIMMER J P.Hereditary dentin defects［J］.Journal of Dental research，2007，86（5）：392-399.

［7］KIM J W，NAM S H，JANG K T，et al.A novel splice acceptor mutation in the DSPP gene causing dentinogenesis imperfecta type 2［J］.Hum Genet，2004，115（3）：248-254.

［8］VERDELIS K，LING Y，SREENATH T，et al. DSPP effects on in vivo bone mineralization［J］.Bone，2008，43（6）：983-990.

R780.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.02.011

2095－6835（2020）02－0040－02

唐杰（1988—），男，安徽肥西人，研究生，住院醫師，研究方向為MTA、iRoot BP、dycal在成熟恒牙深齲意外露髓、外傷露髓中臨床療效評價。

〔編輯：嚴麗琴〕