一株降解煤油菌株的篩選與鑒定

周駿馳， 宋梟梟， 徐 盼， 曹張軍

東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620

石油及其產(chǎn)品在開(kāi)采、煉制、貯運(yùn)和使用過(guò)程中進(jìn)入海洋環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重污染；其中溢油污染危害最大，石油泄漏被稱為海洋污染的超級(jí)殺手。全世界每年因油輪事故溢入海洋的石油約為39萬(wàn)噸[1]，到2016年已有超過(guò)140次大的油泄漏事件將700萬(wàn)噸油泄漏造成環(huán)境污染[2]。石油烴已成為世界海洋(尤其是淺海)的主要污染物。石油污染物與常規(guī)污染物有所不同，一旦污染水域或食物鏈，進(jìn)入人體后不易遭到破壞，并且仍保持它的持久性、累積性、遷移性和高毒性時(shí)，必然危及機(jī)體，表現(xiàn)出致癌性、致變性和致畸性，嚴(yán)重威脅人類健康。對(duì)溢油污染進(jìn)行治理，改善、恢復(fù)污染區(qū)域的生態(tài)環(huán)境，保護(hù)海洋環(huán)境和海洋資源，促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展是世界各國(guó)義不容辭的責(zé)任[3]。

目前處理溢油的方法有物理法(吸附、機(jī)械攔截)、化學(xué)法和生物法[4，5]。化學(xué)法由于使用化學(xué)試劑毒性大，造成生態(tài)環(huán)境危害，難以大范圍廣泛利用。圍欄法、撇油器法、吸油材料法、活性炭吸附過(guò)濾法的物理法主要是應(yīng)對(duì)大規(guī)模、大范圍的海面石油泄漏事故，將原油吸收、捕捉后再分離、回收。但對(duì)于密度小、黏度小，在海面擴(kuò)散速度快的汽煤柴等輕質(zhì)油及大規(guī)模處理后殘余量油，目前工藝方法難以奏效。以油作為生長(zhǎng)底物的微生物處理作為主要的生物處理法，可以作為轉(zhuǎn)化油污污染的生物源，而細(xì)菌修復(fù)具有安全、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、去除效率高和無(wú)明顯的二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)[6]。因此分離篩選到適應(yīng)力強(qiáng)，降解輕油能力高的微生物是生物處理法的關(guān)鍵。

本論文鑒定了一株從從活性污泥中分離到降解輕油微生物，并確定了其生長(zhǎng)適合條件及降解能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

本實(shí)驗(yàn)所用活性污泥由上海市松江污水處理廠提供，油污染土壤取自工廠油污染區(qū)。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0，121℃，滅菌20 min。

固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、瓊脂18.0，pH 7.0，121 ℃，滅菌20 min。

LB種子液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，121 ℃，滅菌20 min。

煤油液體培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 5.0、KH2PO45.0，KCl 0.1，MgSO45.0，CaCl20.02，F(xiàn)eSO40.1，NaCl 15.0，K2HPO41.0，輕油30.0，pH 7.2～7.4，115 ℃，滅菌30 min。

1.2 菌種的富集與篩選

1.2.1菌種的富集馴化[7]

配制含有濃度梯度的油污染土壤的篩選培養(yǎng)基，分別將1 g、2 g和3 g油污染土壤加入裝有100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，121 ℃，滅菌20 min。加入取自上海市松江污水處理廠的活性污泥10 mL。馴化條件為28 ℃，160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。進(jìn)行梯度富集培養(yǎng)。

1.2.2菌種的篩選[8，9]

將富集馴化完的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋為10-2～10-6，用涂布棒涂布于固體牛肉膏蛋白胨平板上。放入恒溫培養(yǎng)箱中在28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取顏色及形態(tài)良好的單菌落，在新鮮的固體牛肉膏蛋白胨上反復(fù)劃線分離，直至菌落形態(tài)一致，鏡檢無(wú)雜菌，將其置于4 ℃冰箱中留存待用。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1菌株的形態(tài)學(xué)觀察[10]

將菌株在LB培養(yǎng)基平板劃線于35 ℃培養(yǎng)，肉眼觀察菌落形態(tài)。并進(jìn)行革蘭氏染色檢驗(yàn)。

1.3.216S rRNA基因序列的基因序列擴(kuò)增、比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析[11]

PCR擴(kuò)增體系為50 μL:上游引物(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)2 μL，下游引物(1522R:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)2 μL，PCR Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，DNA模板5 μL(細(xì)菌沸水5 min，稀釋20倍)，dNTP 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH20 31.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)誤后，送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

所得序列通過(guò)BLAST親緣關(guān)系分析，并用MEGA構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.4 細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)條件研究

1.4.1初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

配制100mL pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(±0.02)的LB培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，按1%接種量接種活化12 h的菌液，35 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)，定期取適量菌液測(cè)定其OD600。

1.4.2溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

配制100 mL pH為7.0的LB培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，按1%接種量接種活化12 h的菌液，分別在23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，160r/min振蕩培養(yǎng)，定期取適量菌液測(cè)定其OD600。

1.5 細(xì)菌降油能力測(cè)試[12]

挑取生長(zhǎng)形態(tài)良好的單菌落，接入5 mL LB液體種子培養(yǎng)基中，35 ℃，160 r/min，置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。接種1 mL種子液于100 mL煤油培養(yǎng)基中，35℃，160 r/min，置于恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 d和7 d。培養(yǎng)完成后，利用30 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，計(jì)算菌種降油能力。按照下列公式計(jì)算菌對(duì)煤油降解率:

降解率(%)=(原始煤油質(zhì)量-培養(yǎng)后剩余煤油質(zhì)量)/原始煤油質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選結(jié)果及形態(tài)學(xué)鑒定

將馴化的菌液稀釋涂布進(jìn)行初篩獲得長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落。再經(jīng)回接、純化和形態(tài)觀察進(jìn)行復(fù)篩，得到生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的單菌落。挑選其中生長(zhǎng)速度最快且長(zhǎng)勢(shì)最佳的菌株作為試驗(yàn)菌，命名為5092-2。5092-2菌種菌落呈白色，圓形，突起，濕潤(rùn)，有光澤，全緣；菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀，長(zhǎng)度5.0 μm～10.0 μm。

2.2 菌種的分子學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增5092-2菌株16S rRNA基因，得到預(yù)期1.5 kb左右大小條帶。擴(kuò)增樣品經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果顯示5092-2菌株為Mangroveibactersp.。利用MEGA6.0構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。

2.3 5092-2菌株生長(zhǎng)條件測(cè)定

菌株5092-2在起始pH為5.0至9.0生長(zhǎng)情況如圖2所示。從圖中可以看出，菌株5092-2在pH 5.0～9.0區(qū)間內(nèi)，生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，具有較強(qiáng)pH適應(yīng)性。

菌株5092-2在培養(yǎng)溫度23 ℃到38 ℃生長(zhǎng)情況如圖3所示。從圖中可以看出，溫度對(duì)菌株5092-2生長(zhǎng)影響不大，特別在26 ℃至35 ℃溫度區(qū)間內(nèi)，生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。

2.4 細(xì)菌降油能力測(cè)試

將煤油和菌混和培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后，萃取培養(yǎng)基中殘存煤油，計(jì)算煤油殘存率。結(jié)果顯示，5092-2降解時(shí)間為5 d時(shí)，煤油剩余質(zhì)量為2.05 g，菌種煤油降解率為31.7%，降解時(shí)間為7 d時(shí)，煤油剩余質(zhì)量為1.43 g，菌種煤油降解率為52.3%。

圖1 菌株5092-2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 起始pH對(duì)5092-2生長(zhǎng)影響

圖3 溫度對(duì)5092-2生長(zhǎng)影響

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)初篩與復(fù)篩得到一株長(zhǎng)勢(shì)最佳的菌株(命名為5092-2)進(jìn)行形態(tài)觀察及分子鑒定，判定菌株5092-2為Mangroveibactersp.。在溫度為35 ℃，pH為7.2～7.4，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為160 r/min，7 d降解煤油能力到達(dá)52.3%，李平等[12]以石化廠附近長(zhǎng)期被石油污染的土壤微生物為菌源，煤油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)條件下，煤油降解率達(dá)到42.6%。KHAN等[13]從受石油烴污染的土壤中分離出SDX7，3%煤油濃度，在最佳培養(yǎng)條件下，16 d培養(yǎng)后降解58%。AYDIN等[14]分理出taphylococcusaureusBa01，DelftiaacidovoransCd11等菌株，以1%煤油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)條件下，21 d培養(yǎng)后降解70%～84%。本論文菌株降解煤油能力明顯，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。