環境絲狀真菌對3種重金屬的耐受性能比較與解析*

毛航球 李文英 高繡紡 李 夏 宋 磊

(1.廣東省農業科學院農業資源與環境研究所，廣東 廣州 510640；2.長江大學資源與環境學院，湖北 武漢 430000；3.濕地生態與農業利用教育部工程研究中心,湖北 荊州 434025)

隨著工農業的發展和化石燃料的燃燒，重金屬在水體、土壤環境中大量富集，使得環境中重金屬污染問題日益嚴重[1]。重金屬污染具有隱蔽性、持續性、不可逆轉性[2]，如何綠色環保地治理重金屬污染問題是各國科研組織和機構研究的熱門話題[3]。微生物修復重金屬污染是近幾十年來興起的環保型、高性價比的修復技術，微生物可以改變重金屬在環境中的化學行為，通過對環境中重金屬進行轉化、遷移或固定從而達到修復的目的，具有成本低、效率高等特點，應用前景十分廣闊[4-5]。

Pb、Cd、Cr是環境中常見的重金屬，可通過食物鏈在生物體內富集，即使少量的污染也會對人體健康產生威脅[6]。國內外研究表明一些真菌對特定的重金屬具有耐受性的同時也對重金屬具較強的生物吸附、轉化等作用。XIE等[7]分離出一株真菌Aspergillusaculeatus對Cd2+有較好的耐受性。ZAFAR等[8]從土壤中分離出的Trichodermasp.和Aspergillussp.對Cd2+和Cr(Ⅵ)有較好的耐受性，特別是后者對Cd2+和Cr(Ⅵ)的吸附量分別達到2.7、1.2 mg/g。宋瑛瑛等[9]測定了Pb2+耐受菌株LadosporiumcladosporioidesB142對Pb2+的吸附能力，結果表明在吸附時間為15、60 min時，其對Pb2+的吸附量分別為14.73、19.54 mg/g。

本研究利用前期從污染環境中分離的11株絲狀真菌，比較了3 種重金屬(Cr(Ⅵ)、Pb2+和Cd2+)對菌絲生長擴展的影響作用及耐受性，觀察測定重金屬對菌株培養性狀和菌落直徑的影響程度，為后續利用高效菌株解決重金屬污染問題提供理論依據和實際參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器

LRH-150型生化培養箱，DE-CJ-1N型超凈工作臺,CL-32L型高壓蒸汽滅菌鍋，游標卡尺，打孔器等。

1.1.2 菌株信息及來源

11株供試真菌為前期從污染環境中分離獲得的純培養菌株，分別為：大單孢屬(Aplosporellasp.)(菌株號Ap1229)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeriasp.)(菌株號Bo1075)、色二孢屬(Diplodiasp.)(菌株號Di0237)、毛色二孢屬(Lasiodiplodiasp.)(菌株號La1636)、毛霉屬(Mucorsp.)(菌株號Mu-tea1)、新殼梭孢(Neofusicoccumsp.)(菌株號Nf1172)、新暗色柱節孢(Neoscytalidiumsp.)(菌株號Ns1680)、青霉屬(Penicilliumsp.)(菌株號Pe-soil2)、暗葡腔菌屬(Phaeobotryonsp.)(菌株號Ph1212)、假殼梭孢屬(Pseudofusicoccumsp.)(菌株號Ps0108)、斯潘氏菌屬(Spencermartinsiasp.)(菌株號Sp1370)。

1.1.3 供試材料及試劑

供試菌株均采用馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基進行培養。實驗所用試劑Pb(NO3)2、CdCl2、K2Cr2O7為分析純。

1.2 實驗方法

分別用Pb(NO3)2、CdCl2和K2Cr2O7配制3種重金屬的高濃度母液(Cr(Ⅵ) 1 000 mg/L，Cd2+100 mmol/L，Pb2+100 mmol/L)，并用微孔濾膜過濾除菌。

對PDA培養基進行高壓蒸氣滅菌(121 ℃，20 min)，待其冷卻到50 ℃左右，加入適量的重金屬母液，配置不同濃度梯度的重金屬培養基(Cr(Ⅵ)為 0、20、40、60、100、160、220 mg/L；Cd2+、Pb2+均為0、3、5、8、12、16、18 mmol/L)，調節pH≤5，防止金屬離子沉淀。在無菌操作臺中用打孔器在空白處理(未添加重金屬)菌落邊緣取生長狀況良好的菌餅(直徑5 mm)，倒置放于重金屬培養基的正中央，于26 ℃生化培養箱中培養。每個濃度設置3個重復，培養觀察14 d，測定菌株最小抑制濃度(MIC)，也即重金屬抑制微生物細胞生長的最低濃度[10]。采用十字交叉法測量菌落直徑并記錄菌落形態(質地、形狀、顏色等)[11]。

1.3 數據處理與統計分析

采用Excel和Origin軟件進行實驗數據處理，SPSS軟件進行多重性比較分析。

2 結果與討論

2.1 11株絲狀真菌對3種不同重金屬的耐受性測定

表1為11株供試菌株在不同濃度Cr(Ⅵ)培養基下的生長情況及MIC。由表1可見，當Cr(Ⅵ)低于20 mg/L時，所有菌株都能生長，逐漸提高重金屬濃度，菌株明顯被抑制，當Cr(Ⅵ)提高到100 mg/L時，菌株Mu-tea1和菌株Pe-soil2可以生長，當Cr(Ⅵ)提高到220 mg/L時，只有菌株Mu-tea1能夠生長。由表1可見，菌株Mu-tea1、Pe-soil2、Nf1172對Cr(Ⅵ)的耐受性能相對更強。

表2為11株供試菌株在不同濃度Cd2+培養基下的生長情況及MIC。從表2可以看出，當Cd2+低于3 mmol/L時，所有供試菌株都能生長，隨著提高培養基中Cd2+濃度提高，菌株生長狀況均變弱，Cd2+為8 mmol/L時大多菌株表現為被抑制，菌落不能明顯延伸，當Cd2+提高到18 mmol/L時，只有菌株Nf1172和菌株Pe-soil2能生長。相比而言，對Cd2+有較強耐受的優勢菌株有Nf1172、Pe-soil2、La1636。

表3為11株供試菌株在不同濃度Pd2+培養基下的生長情況及MIC。從表3可以看出，當Pb2+低于3 mmol/L時，所有供試菌株都能生長，逐漸提高Pb2+濃度，菌株均明顯被抑制，當Pd2+提高到8 mmol/L時，只有菌株Nf1172和菌株Pe-soil2能夠生長，繼續提高Pb2+到18 mmol/L時，只有Pe-soil2可以生長。對Pb2+有較強耐受的優勢菌株為La1636、Nf1172和Pe-soil2。

表1 供試菌株對Cr(Ⅵ)的耐受性1)

注：1)“+”表示能夠生長，“-”表示抑制生長，表2、表3同。

表2 供試菌株對Cd2+的耐受性

表3 供試菌株對Pb2+的耐受性

MIC可以反映菌株對重金屬離子的耐受性程度。從上述結果可以看出，供試菌株對不同種類重金屬的耐受性有較大的差異，這可能與重金屬進入菌絲體內形成不同化合物有關[12]。同一菌株對不同重金屬濃度耐受性也有較大差異，在低濃度條件下，重金屬對菌絲體毒害作用較弱，提高重金屬濃度，其對菌株的抑制毒害作用顯著增強。MUNOZ等[13]從礦區污水中分離出一株Trichosporonsp.對Pb2+的MIC為12～14 mmol/L，本研究中菌株Nf1172、Pe-soil2對Pb2+的MIC為18 mmol/L，說明Nf1172、Pe-soil2對Pb2+有更好的耐受性。OLADIPO等[14]從礦山分離的Bacilluskochii對Cr(Ⅵ)的MIC為150 mg/L，本研究中菌株Mu-tea1對Cr(Ⅵ)的MIC為220 mg/L，耐受性能明顯增強，這可能是由于絲狀真菌生長快、生物量大、有細胞壁等原因，所以對重金屬的抗性能力要優于細菌。

2.2 3種重金屬對強耐受性菌種菌絲生長的抑制作用

真菌在重金屬脅迫培養下的生長狀況可直接反映重金屬對其產生的危害程度。從供試菌株中分別選出對Cr(Ⅵ)、Pb2+和Cd2+耐受性最強的3株菌株，在不同脅迫濃度下培養14 d，觀察菌落直徑的變化。根據表1篩選結果，選擇菌株Nf1172、Mu-tea1和Pe-soil2進行Cr(Ⅵ)脅迫的菌落直徑對比，結果見圖1。

圖1 3株供試菌株在不同Cr(Ⅵ)質量濃度下的菌落直徑Fig.1 The colony diameters of 3 tested fungi strains under different Cr(Ⅵ) concentrations

由圖1可見，3株供試菌株對不同濃度Cr(Ⅵ)的耐受性具有一定的差異性。當Cr(Ⅵ)≤20 mg/L時，其對3株供試菌株抑制效果不明顯，菌落直徑都為9.0 cm。當培養基Cr(Ⅵ)提高至60 mg/L時，菌株Nf1172的菌落直徑為4.3 cm，與Cr(Ⅵ)為0 mg/L的空白處理組相比有顯著性差異(p<0.05)，菌株Mu-tea1和Pe-soil2在Cr(Ⅵ)為60 mg/L下均能正常生長。繼續提高Cr(Ⅵ)至220 mg/L時，只有菌株Mu-tea1能夠擴展，菌落直徑為3.1 cm，與其他菌株相比有顯著性差異(p<0.05)。3株供試菌株對Cr(Ⅵ)的耐受性大小為Mu-tea1> Pe-soil2> Nf1172。不同菌株對Cr(Ⅵ)耐受性差異明顯，可能是菌株體內的官能團通過減少對Cr(Ⅵ)的吸收或增加體內Cr(Ⅵ)的排出量存在差異，從而對Cr(Ⅵ)的抵抗力不同[15]。

根據表2篩選結果，選擇菌株La1636、Nf1172和Pe-soil2在不同濃度Cd2+脅迫下培養14 d進行菌落直徑觀察，結果見圖2。從圖2可以看出，隨著Cd2+濃度的增加，3株供試菌株菌落的直徑均逐漸減小。當Cd2+≤3 mmol/L時，3株供試菌株的菌落直徑均為9.0 cm。提高Cd2+摩爾濃度至8 mmol/L，菌株La1636的菌落直徑為3.3 cm，與Cd2+摩爾濃度為0 mmol/L的空白對照組相比有顯著差異(p<0.05)，而該濃度水平下菌株Nf1172和Pe-soil2的菌落直徑均為9.0 cm。提高Cd2+摩爾濃度至18 mmol/L時，只有菌株Nf1172和Pe-soil2能生長，菌落直徑分別為2.3、2.7 cm，與其他菌株相比差異顯著(p<0.05)。3株供試菌株對Cd2+耐受性大小為Pe-soil2>Nf1172>La1636。菌株Pe-soil2對Cd2+顯現出更好的耐受性可能是因為細胞膜表面的官能團對Cd2+有排斥作用，從而增大其對Cd2+的耐受性[16]。

圖2 3株供試菌株在不同Cd2+摩爾濃度下的菌落直徑Fig.2 The colony diameters of 3 tested fungi strains under different Cd2+ concentrations

根據表3篩選結果，選擇菌株La1636、Nf1172和Pe-soil2在不同濃度Pb2+脅迫下培養14 d進行菌落直徑觀察，結果見圖3。從圖3可以看出，在14 d觀察時間內，當Pb2+≤3 mmol/L時，3株供試菌株的菌落直徑均為9.0 cm。當Pb2+摩爾濃度提高到8 mmol/L時，菌株La1636完全被Pb2+毒性所抑制，菌株Nf1172的菌落直徑為6.7 cm，與Pb2+為0 mmol/L的空白對照組相比有顯著性差異(p<0.05)，而菌株Pe-soil2的菌落直徑仍為9.0 cm。提高Pb2+摩爾濃度至18 mmol/L時，只有菌株Pe-soil2能夠生長，菌落直徑為4.3 cm，與其他菌株相比差異性顯著(p<0.05)。可以看出，3株供試菌株對Pb2+耐受性大小為Pe-soil2>Nf1172>La1636。不同菌株對Pb2+耐受性的差異可能與菌株體內無機酸根離子含量多少有關，Pe-soil2中無機酸根離子含量較高，可與Pb2+離子形成絡合沉淀從而減低體內Pb2+含量。

上述實驗結果表明，菌株Mu-tea1對Cr(Ⅵ)表現出更強的耐受性，而菌株Nf1172和Pe-soil2對Pb2+、Cd2+比其他供試菌株表現出更強的耐受性。不同濃度的重金屬對同一菌株菌絲生長具不同程度的抑制作用，且抑制作用隨重金屬濃度的升高而增強，菌落擴展速率也隨著重金屬濃度的升高而減小。不同菌株對重金屬耐受性差異明顯，可能與菌株細胞內部官能團結構和重金屬影響菌株次生代謝有關。楊超等[17]分離出一株Phaeoacremoniummortoniae對Pb2+脅迫條件下的半致死質量濃度為951 mg/L，本研究中Pe-soil2在18 mmol/L Pb2+條件下能夠生長，菌落直徑為4.3 cm，這是由于絲狀真菌體內的抗氧化酶系統能有效降低活性氧的傷害，分泌多種有機酸，可絡合、沉淀重金屬離子，從而降低重金屬的毒害。徐在超等[18]從礦區分離3株具重金屬抗性的內生真菌Fusariumsp．(菌株號CBRF14)、Penicilliumsp．(菌株號CBRF65)和Alternariasp．(菌株號CBSF68)，對Cd2+的MIC分別達到了20.54、53.43、27.25 mg/L，對Pb2+的MIC分別為299.8、356.6、188.9 mg/L，對Pb2+和Cd2+也表現出較好的耐受性，可能是絲狀真菌通過表面吸附作用，菌絲分泌出多糖物質產生結合作用使重金屬的毒性降低[19]。

3 總 結

(1) 將11株絲狀真菌在含有不同濃度Cr(Ⅵ)、Cd2+、Pb2+的培養基中培養，在高濃度重金屬脅迫條件下菌絲擴展均受到明顯抑制,菌落的形態也有著明顯的變化,證實了Cr(Ⅵ)、Cd2+、Pb2+對真菌的生長具有不同程度的抑制作用。

(2) 不同菌株對不同重金屬耐受能力不同，菌株Mu-tea1對Cr(Ⅵ)耐受能力最強，Nf1172和Pe-soil2對Cd2+、Pb2+耐受能力較強，與其他供試菌株相比具有明顯的優勢。

(3) 本研究供試菌株均從華南特色環境中分離出來，在利用優勢菌株修復華南區域性重金屬污染等方面，具備得天獨厚的優勢，可為下一步研發環境污染控制及微生物修復技術提供科學依據和材料基礎。