枯草芽孢桿菌S44抑菌化合物合成關鍵基因ituD的功能分析

張 慧，杜 娟，趙思峰*

(1. 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室，石河子大學農學院，新疆 石河子 832003；2.重慶市農業科學院農業資源與環境研究所，重慶 401329)

【研究意義】枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其抑菌活性強、抑菌譜廣、對環境和生態健康安全等優點，已被廣泛應用于植物病害的防治上[1-3]。枯草芽孢桿菌在生長過程中能夠產生多種類型的抑菌物質，而脂肽類物質產生是枯草芽孢桿菌表現出較強抑菌活性和較廣抑菌譜的主要原因之一[1-2]。【前人研究進展】枯草芽孢桿菌產生的脂肽類物質主要分為三大家族：伊枯草菌素(iturins)、表面活性素(surfactins)和豐原素(fengycins)，其中iturin和fengycin家族中的環狀脂肽能在病原體入侵植物組織之前抑制真菌孢子萌發[4-5]。iturinA是iturin家族的成員，其抑菌譜廣，對很多植物病原真菌有很強的抑菌活性，是具有重要開發價值的新型生物源農藥[6-7]。iturin A操縱子由ituD、ituA、ituB和ituC4個開放閱讀框組成，其中ituD基因編碼編碼丙二酰CoA轉酰基酶，該基因的缺乏將導致iturin A合成明顯不足[8-10]。iturin A的合成量與芽孢桿菌菌株對植物病害的生物防治效果密切相關[4,11]。 iturin家族中的環狀脂肽也參與群集運動、生物膜形成以及菌落形態。群集動力和生物膜形成是芽孢桿菌菌株在新環境中主要適應性定植策略[12-14]。 PCR和qRT-PCR已被用于研究參與iturin合成的基因表達和抗真菌活性的影響[10,14-15]。【本研究切入點】B.subtilisS44分離自新疆棉田土壤，該菌株對幾種土傳病害有良好的防病效果[16]，同時從S44菌株中克隆到了與 iturin A合成密切相關的ituD基因[17-18]。前人對ituD基因多是對其進行敲除并驗證其抑菌活性[8-10]，對其敲除后定殖能力的研究較少。【擬解決的關鍵問題】本研究采用抗生素標記法，研究野生菌株與ituD基因缺失株S1[19]在土壤中的定殖存活能力，并比較分析ituD基因在野生菌株和缺失菌株中的表達量及其在抗菌物質iturin A的生物合成的功能，為進一步了解該菌株的防病機制和生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 棉花立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)和B.subllisS44由石河子大學綠洲農作物病害防控重點實驗室分離保存。B.subtilisS1為本實驗室構建ituD基因缺失突變菌株。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，pH 7.0，H2O 1000 mL；NA培養基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.2，H2O 1000 mL。

1.1.3 供試土壤 供試土壤為砂質壤土，土壤過1 mm篩后于烘箱中160 ℃高溫滅菌 2 h，冷卻后備用。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性檢測 參照Yoshida等[20]方法。以立枯絲核菌作為檢測菌株，取培養48 h的野生株S44和突變株S1菌液，接于距菌餅2.0 cm處，以無菌LB培養液為對照，對抑菌活性進行檢測。

1.2.2 RT-PCR 將野生型S44、突變體S1接種于50 mL的LB培養液中，30 ℃、200 r/min培養至OD600=1.0。按照TaKaRa公司細菌RNA提取試劑盒以及反轉錄試劑盒操作方法提取細菌總RNA并進行反轉錄cDNA。以野生型S44和突變體S1的cDNA為模板，以引物ituD-R：5′-TGAAGAGGCGAGCGATGCTAT-3′，ituD/F：5′-GCTATGACCTGCCAGAAAGTGC-3′進行PCR反應，檢測ituD基因的轉錄表達量。反應試劑使用TAKARA的SYBR Premix EX TagTM II kit (TaKaRa)，儀器為Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR system。選取rpsJ作為內參基因[21]，上述試驗重復3次。

1.2.3 菌株抗性標記 將S44菌株在LB平板上活化后，挑取單菌落轉入含5 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養24 h，然后在含有5 μg/mL氨芐青霉素LB 平板上劃線培養，將單菌落依次經含有 10、20、50、100 μg/mL氨芐青霉素培養基誘導，直至篩選出穩定的抗性的突變菌株，挑選能穩定生長且保留原始功能的標記菌株[22]，并命名為S44-A。

1.2.4 盆栽試驗 試驗在石河子大學實驗站溫室內進行，供試菌株(S44-A、S1)分別活化后置于 LB 培養基中搖床培養48 h，供試作物為棉花。取滅菌后試驗土，裝入培養缽中，每缽種20粒種子，播種后每 2 d澆施無菌水，保持棉花正常生長狀態。試驗處理如下：S44-A和R.solani同時接種；S1和R.solani同時接種；只接種R.solani病原菌；只接種無菌水對照。試驗設置4個處理，每個處理3次重復。自然條件下室內培養，14 d后，調查并記錄各處理的棉苗株高、干重和發病率。

1.2.5 標記菌株在棉花根際定殖 在種植第0、3、14天，收集S44-A和S1處理棉花根際土壤5 g，加入到45 mL無菌水中，室溫下140 r/min振蕩30 min，85 ℃水浴30 min后分別按1×10-6、1×10-7和1×10-8梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于含5 μg/mL四環素和含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中，每個稀釋度做3個重復，于37 ℃培養箱中培養，3 d后對細菌菌落進行計數。

1.2.6 土壤中iturinA的量測定 在種植第0、3、14天，分別取S44-A和S1處理的根際土壤3 g，懸浮于21 mL的乙腈和3.8 mM的三氟乙酸(4∶1，v/v)的混合物中，室溫140 r/min振搖1 h。使用滅菌濾紙除去土壤，將濾液烘干。所得的沉淀物用2 mL的甲醇萃取2 h，萃取液以13 525 r/min離心2 min，通過0.22 μm的小孔過濾器，濾液注入HPLC柱(Lichrospher C18, 250 9 4.6 mm，Agilent Technologies Corporate)，USA)。然后在Waters 2695 HPLC系統上以0.9 mL/min的流速操作。使用乙腈和10mM乙酸銨(35∶65，v/v)的混合物作為洗脫液，檢測波長為210 nm，具體方法參考文獻[9,23]。

1.2.7 數據處理 利用 Microsoft Excel 2010 和 SPSS19.0 軟件進行數據分析及制圖，采用單因素方差分析法分析各組數據差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 ituD基因表達和抑菌活性檢測

通過對基因缺失后的ituD相關基因表達量進行測定(圖1)，結果發現，與野生型菌株S44相比，ituD基因在S1菌株中幾乎不表達。將S1與S44-A的抗真菌活性進行比較(圖2)，與S44相比，S1(圖2-A和2-B)顯示沒有抗真菌活性(圖2-D)，表明ituD基因破壞導致iturin A缺乏。

圖1 芽孢桿菌菌株的ituD基因表達Fig.1 Gene expression of ituD by Bacillus strains

C為對照；A、B 為S1發酵液的粗提物；D為S44發酵液的粗提物處理C indicated as control; A and B indicated the supernatants of fermentation from S1 strains;D indicated the supernatants of fermentation from S44 strains

2.2 S44-A和S1防治效果

如表1所示，在未加R.solani的處理土壤中，所有的棉花種子均能正常生長，且沒有病害發生。R.solani的處理的土壤中，植物的發病率為94.9 %，株高和干重都明顯的低于未加R.solani的處理。S44-A處理的種子發病率為26.1 %，株高比加R.solani處理低1.7 %，干重比加R.solani處理高21 %；株高比未加R.solani處理低24 %，干重比未加R.solani高25 %；株高比S1處理低1.2 %，干重比S1處理高26 %。S1處理的種子，株高和干重比加R.solani分別低0.5 %和3.6 %，發病率為95 %，與對照沒有顯著差異。

表1 菌株對棉苗立枯病的防治效果

2.3 菌株在土壤存活量檢測

由表2可知，經S44-A和S1處理后的棉苗，土壤菌株生物量均下降，0～3 d下降速率較緩，在第14天，S44-A處理土壤生物量降低較為緩慢，而S1處理土壤菌株生物量下降較為迅速，僅有51.5，可能是由于ituD的缺失使菌株S1不能以孢子的形態穩定的在土壤中存活。盡管土壤最初是經過滅菌處理，但是盆栽實驗是露天進行，土壤暴露在空氣中，許多因素都會影響細菌的存活數量。但是這些因素對S44-A的細菌數量的影響相對較小。

表2 土壤中菌落數

2.4 土壤中iturinA的量

由表3可知，經S44-A處理后，采集根際土壤進行iturin A檢測，在種植后，檢測出土壤中iturin A的量為13.54 μg/g，隨著時間推移，iturin A的量逐漸減少，在第14天仍能檢測到少量的iturin A，由于土壤中S44-A存活量的減少，iturin A也逐漸減少。然而，在S1處理中土壤中均沒有檢測到iturin A。

表3 土壤中iturin A的濃度

3 討 論

在細菌中，對于某個特定基因的功能研究一般要構建突變株來進行比較研究。以往的研究表明，相關基因表達量、抗菌脂肽類物質的合成、菌落活性與其對植物病害的抑制作用密切相關[10,14-15,24]。因此，本研究是通過比較野生型S44和基因缺失突變株S1來分析ituD的功能。通過對野生菌S44和S1菌株的比較發現，ituD基因缺失后，與野生型相比，S1菌株沒有抑菌活性，這表明ituD基因缺失導致iturin A的減少，致使S44菌株沒有抑菌活性。與野生型相比，在突變體菌株S1中ituD基因幾乎不表達。

生防治劑通常通過施用于土壤中，因此根際定植能力和菌株的存活量是生物防治的先決條件。通過梯度法篩選出對氨芐青霉素抗性較高的菌株，為后期菌株定殖與存活研究提供基礎。本研究中篩選氨芐青霉素抗性菌株，為驗證其生物學功能，我們進行盆栽實驗，結果表明在R.solani的處理的土壤中，S44-A處理的發病率為26.1 %，與野生菌株[17]發病率相當，完全可以應用于后續研究。

B.subtilis能夠以孢子的形態穩定的在土壤中存活，這是該細菌成為生物防治劑的優點。雖然B.subtilis的營養細胞很容易在土壤中死亡，但孢子能存活至少2個月[25]。Mizumoto[23]等對lpa-14基因進行敲除，發現缺失菌株R△1在14 d仍有大量的孢子存活，而本研究中S1處理孢子僅有51 CFU/g干土，可能是由于ituD基因的缺失，從而影響了孢子的存活，使菌株不能有效的定殖。

土壤中iturin A的量對植物病原真菌起重要的作用，土壤中iturin A在幼苗發芽之前就將R.solani殺死[26]。在本研究中，S44-A處理的土壤中均提取到iturin A，而在S1處理的土壤中未檢測到iturin A。S44-A處理的土壤中，隨著時間推移iturin A的量逐漸較少，在第14天仍能檢測到4.27 μg/g，iturin A量的減少可能是由于土壤的化學降解、土壤的不可逆吸附或者空氣中污染物的降解。土壤的可降解性和iturin A的短暫持久性可能是生物菌劑優于長期在土壤中持久存在的化學農藥的一個優點[23]。盡管iturin A提取物對多種病原真菌有較強的抑制作用[26-29]，但是否提高iturin A濃度會增加iturin A在土壤中的效力還有待研究[24]。

4 結 論

本研究對B.subtilisS44菌株ituD基因功能進行分析，通過抑菌試驗和qRT-PCR分析野生菌株S44及ituD缺失菌株S1中ituD基因的表達量，發現ituD基因幾乎沒有表達，其抑菌活性喪失。且盆栽實驗顯示S1菌株幾乎沒有抑制效果；進一步測定土壤中菌含量，采用HPLC對土壤中的iturin A進行檢測，S44-A菌株能在土壤中穩定定殖，14 d后在土壤中檢測到iturin A；與S44-A相比S1隨著時間推移存活量較少，并且在14 d后土壤中未檢測到iturin A。本研究結果表明，ituD基因是S44菌株抑菌物質產生、菌株在植物根際定殖與調控的關鍵因子。