油菜附加系EE抗根結線蟲的蛋白質組學初步研究

余 萍，董 超，羅紅梅，Holger Budahn，張紹松*

(1.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223； 2.植物育種研究中心園藝作物研究所，德國 奎德林堡 06484)

【研究意義】根結線蟲 (Meloidogynespp.) 是世界性重要植物病原線蟲，也是中國農作物最主要的病原線蟲[1]。其適應性強，傳播途徑多樣，寄主范圍廣，給農業經濟造成嚴重的損失[2]。據不完全統計，全球每年因線蟲危害所造成的農作物損失多達1000億美元，其中50 %的經濟損失是由根結線蟲侵害造成的[3-4]。近些年，線蟲病的發生日趨嚴重，已成為當前農業生產中亟待解決的一個問題。控制根結線蟲目前應用較廣的是殺線蟲劑，但在土壤及植株中殘留時間長，對生態環境破壞大，大多歐洲國家已經禁止使用。因此，發掘和利用抗根結線蟲病的抗性資源是最有效、最經濟的防控措施。【前人研究進展】抗根結線蟲的R基因已經從多種植物中分離。第1個分離克隆的抗根結線蟲R基因是來源于番茄的Mi-1.2基因[5](Vos et al., 1998)，隨后，來源于馬鈴薯的Gpa2和Rmc基因[6-7]，番茄的Mi9基因[8](Jablonska et al., 2007)，櫻桃李的Ma基因[9](Claverie et al., 2011)，棉花的GHNTR1基因[10](Zhang et al., 2015)，基因甜椒的Me[11](Celik et al., 2016)等相繼被克隆。油蘿卜是十字花科蘿卜屬蘿卜的變種，具有優良的抗病蟲基因，如抗根結線蟲和孢囊線蟲，及其它抗旱、抗寒、耐酸堿等優良特性。已有研究表明抗甜菜胞囊線蟲基因Hs1Rph定位在油蘿卜D染色體上[12](Budahn et al., 2009)。另外，抗性測定結果顯示，油蘿卜E染色體攜帶該抗性基因[13](Zhang et al., 2014)。【本研究切入點】蛋白質組學是一種前沿的方法，用于揭示蛋白質的動態變化，以應對不同的壓力因素，包括生物和非生物脅迫。以接種南方根結線蟲的油菜(感病)和油菜附加系EE(抗病)的根系為材料，通過蛋白質組學經典的雙向電泳方法，結合生物信息學分析，篩選差異表達的蛋白質及預測它們間的關系，以找到與抗線蟲密切相關的蛋白質。【擬解決的關鍵問題】為培育抗性品種提供基因資源，并揭示植物-根結線蟲互作機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料和線蟲培養

以抗根結線蟲的油菜附加系EE和感根結線蟲的油菜Madora為材料。將該種植株的種子在育苗盤中播種。1個月后，將幼苗移植到9 cm× 9 cm的塑料盆中，該盆中含有400 g包括根結線蟲的病土。經測定該病土主要含有南方根結線蟲和少量的花生根結線蟲，爪哇根結線蟲。 植物在氣候室18 ℃下培養16 h ，13 ℃，晝夜8 h，持續2個月。 收集根為樣品儲存在-80 ℃備用。

1.2 試驗方法

參考Yu P等的方法[14]。即用TCA/丙酮法分別從3.0 g Madona和Madona ee根中提取總蛋白。使用Bradford方法[15]測定蛋白質濃度。分別使pH 4～7的IPG膠條吸收含600 μg總蛋白質的500 μl水化緩沖液(7 M尿素，2 M硫脲，4 %CHAPS，65 mM DTT，0.2 %IPG緩沖液，0.001 %溴酚藍)中。在IPGphor II中進行等電聚焦：250 V 30 min，500 V 30 min，1000 V 30 min，8000 V 4 h和8000 V 65000 Vh。聚焦完成后依次置于平衡緩沖液-1(6M尿素，2 %SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8,20 %甘油，2 %DTT)和平衡緩沖液-2(6M尿素，2 %SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8,20 %甘油，2.5 %碘乙酰胺)中分別平衡20 min。轉入含12.5 %SDS-PAGE凝膠的GE Ettan DAL Tsix儀器中垂直電泳。電泳后將凝膠用Coomassie Brilliant Blue G-250染色， UMAX Power Look掃描儀以300 dpi灰度模式分辨率掃描， Image Master 2D Platinum軟件5.0版(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden)進行分析。篩選出分離清晰且具有2倍或更多表達差異的蛋白質點進行質譜鑒定。

1.3 質譜鑒定

蛋白質點經胰蛋白酶酶解，提取和Ziptip脫鹽過程，然后取1 μl溶解樣品點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取0.6 μl過飽和CHCA基質溶液點至對應靶位上并自然干燥。樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽并用串聯飛行時間質譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF, AB SCIEX)進行測試分析，激光源為波長349 nm 的Nd:YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，一級質譜(MS)掃描范圍為800～4000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜(MS/MS)分析，每個樣品點上選擇10個母離子，二級質譜(MS/MS)累計疊加2500次，碰撞能量2 kV，CID關閉。質譜測試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索NCBInr Brassica_rapa和Raphanus_sativus數據庫，最后得到鑒定的蛋白質結果。

1.4 生物信息學分析

通過GO(http://www.geneontology.org/)和WEGO(http://wego.genomics.org.cn/)進行顯著差異表達蛋白質的功能注釋。 WOLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort)用于預測目標蛋白的亞細胞定位。 KEGG(http://www.kegg.jp/)用于分析差異表達蛋白質參與的代謝途徑。 STRING(http://www.string-db.org/)用于構建差異表達蛋白質之間的相互作用網絡。

2 結果與分析

2.1 差異表達蛋白的鑒定

為了從蛋白水平揭示植物的抗線蟲機制，通過2-DE 和 質譜技術研究油菜附加系EE和其供體油

菜Madora 根系差異表達蛋白。 選擇pH 4～7的IPG膠條和12.5 %的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離植株根系總蛋白質。利用Image Master 5.0分析2-DE掃描 圖譜。圖1顯示Madora和油菜附加系EE分別有 1184和1163 個蛋白點。 以Madora為對照，油菜附加系EE與其相比較，經MALDI-TOF/TOF 質譜成功鑒定了21個差異表達蛋白質，其中蛋白質表達量上調的有12個，下調的有9個(表1)。

圖1 植株根部的2-DE圖譜Fig.1 The 2-DE maps of plant roots

表1 MALDI-TOF/TOF 質譜鑒定油菜附加系EE和油菜Madora根部差異表達蛋白質

續表1 Continued table 1

2.2 差異蛋白的生物信息學分析

為了闡明差異表達蛋白的功能，通過GO功能分類系統鑒定了這些蛋白的生物過程，分子功能和細胞成分。 結果表明這些蛋白主要分為細胞成分中的細胞，細胞部分和細胞器，分子功能中的結合和催化作用，生物過程中的細胞過程，代謝過程和應激反應(圖2)。 WoLF PSORT預測了這些蛋白質的亞細胞定位，其主要定位于細胞外(52.38 %)，其次是細胞質(28.57 %)，葉綠體(4.76 %)，線粒體(4.76 %)，內質網(4.76 %)，液泡(4.76 %，圖3)。

圖2 GO和WEGO的功能分類Fig.2 Functional classifications from GO and WEGO

圖3 鑒定蛋白質的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of the identified proteins

通過STRING對所有差異表達的蛋白質繪制蛋白質-蛋白質相互作用網絡(圖4)。 該圖顯示，胰蛋白酶抑制劑BvTI(Bra003850.1-P)，V型質子ATP酶催化亞基A(Bra003633.1-P)和核苷二磷酸激酶1樣亞型X1(Bra030844.1-P)是獨立的，與其他蛋白質無關。 然而，ATP合成酶β-2亞基(Bra028648.1-P)，蘋果酸脫氫酶1(Bra039662.1-P)，S-腺苷甲硫氨酸合成酶3(Bra023084.1-P)和S-腺苷甲硫氨酸合酶亞型X2(SAMS-P)4個蛋白質具有一定的相關性。3-異丙基蘋果酸脫水酶大亞基(Bra032708.1-P)，微管蛋白α-6鏈(Bra018825.1-P)，表皮特異性分泌糖蛋白EP1(Bra035070.1-P)，內源性α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑樣(Bra016070.1-P)，BnaC04g03560D(Bra004819.1-P)和BnaC06g3421 0D(Bra016002.1-P)6個蛋白質具有一定的相關性。

圖4 差異表達蛋白質的蛋白質-蛋白質相互作用網絡Fig.4 Protein-protein interaction network of the differentially expressed proteins

為了明確差異表達蛋白參與的代謝途徑，KEGG用于確定它們屬于哪種類型的生化代謝途徑。結果顯示，共有7種蛋白質參與代謝途徑，分別為XP_013676805.1和XP_013673398.1共同參與氧化磷酸化； XP_013748848.1參與檸檬酸循環，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙酮酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，光合生物中的碳固定和碳代謝等多種代謝途徑； XP_013723181.1和XP_013722790.1共同參與了氨基酸的生物合成；另外，核苷二磷酸激酶1樣亞型X1(XP_013649391.1)參與了MAPK信號通路；微管蛋白α-6鏈(XP_013640865.1)參與了吞噬體。

圖5 差異表達蛋白的KEGG途徑Fig.5 Images of differentially expressed proteins in KEGG pathway

3 討 論

植物寄生線蟲是農業生產中一種常見的病原物，全球每年因植物寄生線蟲造成的農作物損失約800億～1570億美元不等[16]。其中，危害最為嚴重的為根結線蟲。由于其非特異性、癥狀隱蔽、缺乏明顯損傷而常常被誤診或被忽視。

油蘿卜是十字花科蘿卜屬蘿卜的變種，具有優良的抗生物脅迫和非生物脅迫的抗性基因。經長期的雜交選育，已獲取9個油菜附加系。其中，油菜附加系EE是油蘿卜的E染色體以二倍體形式存在于油菜Madora中，用于研究單個油蘿卜染色體對抗性行為的影響。經油菜附加系的抗性測定結果顯示，油蘿卜E染色體攜帶抗根結線蟲的基因[13]。因此，為了鑒定油蘿卜E染色體可能參與介導的抗性蛋白質，將油菜附加系EE與油菜Madora進行比較。21個蛋白質被成功鑒定，其中12個蛋白質上調。上調的蛋白質中，4個蛋白質被鑒定為kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑DrTI，3個蛋白質為內源性α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑。

蛋白酶抑制劑廣泛分布于自然界中，特別是植物的貯藏器官，如種子和塊莖中，具有調節細胞凋亡并保護植物免受昆蟲、線蟲和微生物等病原體的侵害[17]。絲氨酸蛋白酶抑制劑是最多樣化的蛋白酶抑制劑超家族，在許多生物過程中扮演著重要角色，例如血液凝固，纖維蛋白溶解、發育、炎癥、組織損害、免疫防御、酚氧化酶原激活和脊椎動物、無脊椎動物的補體系統[18]。Kunitz型蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸家族，幾乎所有生物中都存在，通過調節絲氨酸蛋白酶的蛋白水解活性，參與免疫反應預防血吸蟲病[19]。α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑為雙功能抑制劑，具有抑制蛋白酶和內源性α-淀粉酶的作用，大量存在于植物種子中，在水稻、大麥、小麥等多種植物中已有報道，具有參與針對微生物的植物防御系統[17]。該基因在大麥發育中的果皮中特異性表達表明該蛋白質主要與種子對病原體的防御有關。 該蛋白可能通過特異性的抑制大麥α-淀粉酶的作用使真菌無法獲取種子的淀粉[20]。首次在中草藥川芎根莖中發現α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑，并研究表明該基因對轉基因工程有用，以提高植物對害蟲和微生物的抗性[21]。

本研究表明Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑和α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑在接種根結線蟲的油菜附加系EE中均上調，上調幅度最大的可達13.52倍。說明這2種蛋白酶抑制劑可能在油菜附加系EE抗根結線蟲過程中起著重要作用。將蛋白酶抑制劑制成的生物農藥或轉基因植物用于防治根結線蟲能有效減少化學殺線劑的使用，改善環境和維持生態平衡。

為了進一步驗證蛋白酶抑制劑參與抗線蟲機制，應在線蟲感染到卵塊發育的時間范圍內更詳細地測量它們的表達水平。 同時，應用細胞學方法研究進食位點的發育。

4 結 論

油菜附加系EE通過調節參與應激反應的蛋白酶抑制劑的表達量上調和表皮特異性分泌糖蛋白、微管蛋白等蛋白質表達量的下調作用抵抗根結線蟲的侵染。