葉片濕潤時(shí)間與田間相對濕度對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生狀況的影響

劉若妍，李文學(xué)，顧沛雯*，李嘉鴻

（1. 寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

葡萄霜霉病是一種世界性葡萄病害。葡萄感病后，可導(dǎo)致葉片早期脫落，果實(shí)品質(zhì)變劣，對樹勢以及產(chǎn)量造成極大影響[1-2]。國內(nèi)外研究表明，該病害的發(fā)生與田間溫濕度以及葉片濕潤時(shí)間密切相關(guān)。在國外，Thind等[3]認(rèn)為霜霉孢子囊萌發(fā)的溫度范圍為3～30 ℃，最適溫度為25～30 ℃。Rumbolz等[4]認(rèn)為濕度為95%～100%，伴有游離水的存在時(shí)是孢子囊形成的最適條件。Gobbin等[5]認(rèn)為，在田間相對濕度為92%及以上、濕度持續(xù)時(shí)間超過7 h時(shí)葡萄霜霉病即發(fā)生。在國內(nèi)，沙月霞等[6]認(rèn)為孢子囊萌發(fā)溫度為5～27 ℃；葡萄霜霉病接種后，在相對濕度76%的條件下即可發(fā)生，且濕度越高發(fā)病越重。靜大鵬等[7]認(rèn)為葡萄霜霉菌的孢子囊只有在水中才能萌發(fā)，菌液與葉片接觸時(shí)間越長，葡萄霜霉病發(fā)生越早，程度越嚴(yán)重。趙勝榮等[8]認(rèn)為田間相對濕度大于或等于80%時(shí)，隨著累計(jì)天數(shù)增加，發(fā)病率和病情指數(shù)均增長。

目前，國內(nèi)對葉片濕潤時(shí)間和田間相對濕度與霜霉病發(fā)生狀況的研究多數(shù)以鮮食葡萄為研究對象，而對釀酒葡萄卻鮮有報(bào)道。寧夏賀蘭山東麓地處世界葡萄種植“黃金地帶”[9]，釀酒葡萄種植面積達(dá)3.3萬 hm2[10]。近年來，隨著釀酒葡萄種植面積不斷擴(kuò)大，病蟲危害逐年加重，尤其是葡萄霜霉病常年的病情指數(shù)可達(dá)30%～35%，流行年份的病情指數(shù)高達(dá)60%[11-12]；霜霉病的流行嚴(yán)重影響釀酒葡萄質(zhì)量與產(chǎn)量，成為葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要制約因子之一。針對此情況，本試驗(yàn)以寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄為對象，采用離體葉片接種法，研究室內(nèi)不同保濕條件以及菌液和葉片接觸時(shí)間與釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的關(guān)系；同時(shí)定點(diǎn)監(jiān)測田間相對濕度，結(jié)合田間發(fā)病情況調(diào)查，研究田間相對濕度對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生狀況的影響。為賀蘭山東麓釀酒葡萄霜霉病的有效監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試葉片

2018年8 月采集寧夏賀蘭山東麓蒲尚酒莊田間‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5節(jié)位上生長的健葉。用清水沖洗，再用75%的酒精消毒，確保葉片上無蟲卵及害蟲等干擾因素后，再用無菌水沖洗5次，自然晾干后備用。

1.1.2 供試菌液

田間采集典型葡萄霜霉病菌葉片，用清水沖洗多次，直至將灰塵洗凈。接著用小毛筆刷下病葉葉背霉層配置成菌懸液，用移液槍吸取200 μL菌懸液均勻滴加到健康葉背上，然后將健康葉片放在保濕培養(yǎng)箱中24 ℃條件下保濕培養(yǎng)，待健康葉片生長出新的霉層，再用小毛筆刷下配置成菌懸液。用計(jì)數(shù)板測定其濃度，確保濃度范圍在1×106～2×106個(gè)/L，備用。

1.1.3 田間相對濕度數(shù)據(jù)監(jiān)測

使用佳多農(nóng)林小氣候信息采集系統(tǒng)。利用L92-1溫濕度監(jiān)測器等設(shè)備對田間溫度（-40～60 ℃，分辨率0.1 ℃）、相對濕度（Relative humidity，RH）（0～100%，分辨率0.1% RH）等數(shù)據(jù)的采集。

1.2 方法

1.2.1 葡萄霜霉病侵染過程及病原的觀察

選擇大小基本一致的‘赤霞珠’葡萄第3～5節(jié)的健康葉片若干，將葉片葉背朝上放入鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，然后在葉背標(biāo)記5個(gè)孢子懸浮液點(diǎn)，用移液槍吸取200 μL制備好的孢子囊懸液滴到健康葉片上，接種3 h后用脫脂棉吸凈。將接種好的葉片放到24 ℃、75%RH的保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用體視顯微鏡觀察并記錄同一葉片在不同保濕時(shí)間下霜霉病的侵染情況，2 h一次，直到癥狀內(nèi)眼可見，選擇侵染變化明顯的情況進(jìn)行分析。用小毛筆刷下其他葉片在不同保濕時(shí)間下新生的霉層，配制成懸浮液，將懸浮液滴在載玻片上，然后正置于熒光相差顯微鏡下觀察病原的形態(tài)。

1.2.2 菌液接種時(shí)間與保濕條件對霜霉病發(fā)生的影響

采用離體葉片接種法，選擇大小基本一致的‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5節(jié)的健康葉片。將樣品葉片的葉背朝上放入鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄用濕潤的脫脂棉包住，然后在葉背標(biāo)記5個(gè)孢子懸浮液點(diǎn)，再用移液槍吸取200 μL菌懸液分別滴加至每個(gè)點(diǎn)，同時(shí)以等量清水接種為對照。待菌液分別在葡萄葉片上分別保持1 h、3 h、5 h、7 h后用脫脂棉吸凈接種液。將接種完成的葉片放在室內(nèi)24 ℃、12 h光暗交替，且相對濕度為75%、85%和95%的保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每次處理10片葉，重復(fù)3次。觀察霜霉病發(fā)病始期1 h、3 h、5 h、7 h、9h、12 h、16、20 h、24 h、48 h后的發(fā)病情況并計(jì)算病情 h指數(shù)。

1.2.3 田間相對濕度對葡萄霜霉病發(fā)生情況的影響

在7月15日至9月25日期間，監(jiān)測田間葉幕間溫濕度數(shù)據(jù)，每日間隔1 h記錄1次葉片周圍溫濕度，每日記錄24個(gè)數(shù)值。統(tǒng)計(jì)每天田間相對濕度75%及以上持續(xù)時(shí)間，同時(shí)結(jié)合每3～5 d的霜霉病發(fā)生情況調(diào)查。

1.2.4 發(fā)病情況調(diào)查

室內(nèi)和田間的病情調(diào)查均采用9級記載法[13]，根據(jù)病斑

面積占葉面積的百分率劃分嚴(yán)重度分級指標(biāo)：

0級：葉片無病斑；

1級：葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；

3級：葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～25%；

5級：葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的26%～50%；

7級：葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的51%～75%；

9級：葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的75%以上。

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×該級代表值)/(調(diào)查病葉盤數(shù)×最高級代表值)]×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄霜霉菌侵染過程及病原觀察

由圖1可知，在24 ℃、75%RH的情況下，釀酒葡萄霜霉孢子囊在葉片表面局部的侵染過程。保濕2 h時(shí)，葉柄處長出霜霉孢子囊（圖1B）；保濕6 h后生出菌絲（圖1C）；保濕12 h時(shí)，孢子囊產(chǎn)生新的游離孢子，進(jìn)行大面積侵染（圖1D）；保濕20 h時(shí)，孢子囊侵染葉片，霜霉病癥狀肉眼可見（圖1E）。

如圖2所示，在24 ℃、75%RH的情況下，不同保濕時(shí)間下的病原形態(tài)。保濕2 h時(shí)，有少量孢囊梗和孢子囊存在，霜霉菌的孢囊梗可形成直角分枝，孢子囊無色透明，呈卵圓或橢圓狀，無菌絲（圖2A）；保濕12 h時(shí)，孢囊梗和孢子囊數(shù)量增多，且有透明細(xì)管狀菌絲生成，菌絲與孢囊梗縱橫交錯(cuò)（圖2B）。

2.2 室內(nèi)接種時(shí)間與保濕條件對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的影響

2.2.1 室內(nèi)接種時(shí)間對‘赤霞珠’霜霉病發(fā)生的影響

由圖3、表1可知，在75%RH的條件下，菌懸液與葉片接觸1 h后，最早出現(xiàn)癥狀時(shí)間是保濕5 h；保濕24 h時(shí)，葉片可見針狀或點(diǎn)狀病斑（圖3A）。菌懸液與葉片接觸3 h后，最早保濕3 h出現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為1.22；保濕7 h后病情指數(shù)有明顯差異；保濕24 h時(shí)，葉片可見點(diǎn)狀白色霜霉層（圖3B）。菌懸液與葉片接觸5 h后，保濕3 h葉片即出現(xiàn)癥狀；保濕5 h、7 h和9 h對霜霉病的影響程度差異明顯；保濕24 h時(shí)，葉片可見片狀白色霜霉層，發(fā)病情況較菌液留存為3 h的葉片更重（圖3C）。在菌懸液與葉片接觸7 h后，保濕9 h時(shí)病情指數(shù)達(dá)到最高，為20.25；同時(shí)霜霉病癥狀最為嚴(yán)重，保濕24 h時(shí)，葉片上霜霉菌絲生長較為密集，連接成白色霉層，面積較大（圖3D）。綜上所述，在75%RH的條件下，葡萄霜霉病菌懸液與葉片接觸1 h即可導(dǎo)致‘赤霞珠’發(fā)病，接種后保濕3 h為最早發(fā)病時(shí)間，需要菌液在葉片上至少留存3 h；接種時(shí)間越長，霜霉病出現(xiàn)癥狀越早、程度越重；同時(shí)隨著保濕時(shí)間增長，接種時(shí)間長的葉片發(fā)病癥狀更顯著。

2.2.2 不同濕度處理下‘赤霞珠’霜霉病的發(fā)病情況

由表2可知，在75%RH、85%RH的條件下，兩者保濕5 h前發(fā)病情況差異均不明顯，但在不同的保濕時(shí)間下，85%RH的病情指數(shù)均高于75%RH；在95%RH的條件下，保濕1 h后發(fā)生狀況即有明顯變化，且病情指數(shù)均高于75%RH、85%RH，保濕20 h時(shí)，病情指數(shù)達(dá)到最高，為42.78；表明在葡萄霜霉病菌懸液與葉片接觸3 h后，隨著濕度的增高，霜霉病發(fā)生的越早，且發(fā)病程度越嚴(yán)重。保濕3 h時(shí)，75%RH的葉片霜霉病病情指數(shù)為1.22，95%RH的病情指數(shù)達(dá)到8.33，兩者相差7.11；而保濕20 h時(shí)，75%RH的病情指數(shù)是25.56，95%RH的病情指數(shù)是42.78，兩者相差17.22；說明隨著保濕時(shí)間的延長，不同濕度之間的差異也越明顯，霜霉病在高濕條件下蔓延的速度更快。

表1 菌懸液與葉片接觸時(shí)間對釀酒葡萄霜霉病發(fā)生的影響Table 1 Effect of contact time between bacterial suspension and leaves on downymildew of vitis vinifera (RH=75%)

表2 菌懸液與葉片接觸3 h后不同濕度處理下釀酒葡萄霜霉病的發(fā)病情況Table 2 The incidence of downy mildew of vitis vinifera under different humidity treatments after contact with the leaves for 3 h

2.3 釀酒葡萄品種在室內(nèi)條件下霜霉病的發(fā)生情況

由表3可知，不同菌液存留時(shí)間和相對濕度對不同品種的影響不同。在75%RH的條件下，菌液存留1 h后，‘紫大夫’的病情指數(shù)為30.89，大于‘赤霞珠’的病情指數(shù)25.56；在菌液存留3 h后，‘赤霞珠’病情指數(shù)為41.73，超過了‘紫大夫’的病情指數(shù)34.44；表明隨著菌液存留時(shí)間的增高，‘赤霞珠’侵染速度更快，發(fā)病程度更重。在菌液存留1 h的情況下，75%RH和85%RH時(shí)，‘赤霞珠’的病情指數(shù)均小于‘紫大夫’；但在95%RH時(shí)，‘赤霞珠’病情指數(shù)高于‘紫大夫’；表明‘紫大夫’發(fā)病對濕度以及接種時(shí)間的要求相對低于‘赤霞珠’，更易發(fā)病；同時(shí)表明隨著濕度增高，‘赤霞珠’發(fā)病速度越快，程度越重。

表3 不同條件下‘紫大夫’和‘赤霞珠’的發(fā)病情況（保濕48 h）Table 3 The incidence of 'Dunkelfelder' and 'Cabernet Sauvignon' under different conditions (moisturizing 48 h)

2.4 田間相對濕度對赤霞珠霜霉病發(fā)生的影響

由圖4可知，在7月20日至24日夜間，葉片平均濕潤時(shí)間最高達(dá)到6 h后霜霉病癥狀發(fā)生，白天則需要達(dá)到8 h后才能發(fā)生；由于自然濕度條件受環(huán)境影響比較大，同時(shí)溫度和風(fēng)速會(huì)加快干燥的速度，所以延長發(fā)生的時(shí)間；白天溫度較高，干燥的速度比夜晚更快，所以白天需要的時(shí)間更長。從8月17日開始，田間濕潤時(shí)間增多，且夜晚的累計(jì)濕潤的時(shí)間比白天長，同時(shí)病情指數(shù)增高；在8月18日病情指數(shù)為17.93，在10月3日達(dá)到57.37；表明夜間濕潤對霜霉病的發(fā)生和蔓延影響比白天更大，說明霜霉病主要在夜晚傳播；隨著田間相對濕度持續(xù)的時(shí)間越長，病害發(fā)生程度逐漸加重，這與室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

目前，國外對霜霉病發(fā)生狀況的研究報(bào)道較多。在位于美國西部沿海，典型的地中海氣候的加利福尼亞州，病原體通過雨水和風(fēng)吹散傳播，感染過程需要1.5 h左右，通常發(fā)生在早晨[14]。Koopman等[15]認(rèn)為，在室外霜霉孢子囊的形成相對濕度必須在95%～100%，同時(shí)最佳的溫度條件是20～25 ℃。Altizer等[16]認(rèn)為孢子體在一天內(nèi)形成，其必要條件是在黑暗環(huán)境下保持4 h。

沙月霞等[6]學(xué)者對賀蘭山東麓地區(qū)釀酒葡萄霜霉病的發(fā)病情況進(jìn)行研究，明確在賀蘭山東麓地區(qū)，當(dāng)室外濕度高于76%時(shí)，霜霉病即可發(fā)病。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在室內(nèi)濕度為75%的條件下，葡萄霜霉菌接種后保濕3 h為最早發(fā)病的時(shí)間；室外環(huán)境濕度條件受到的干擾因素較多，所以保濕6 h為葡萄霜霉病最早發(fā)病時(shí)間，但不排除保濕3 h時(shí)有潛在發(fā)病隱患；接種時(shí)間越長，霜霉病發(fā)病越早、越重；濕度的增高，縮短了侵染的時(shí)間，使霜霉病的病情指數(shù)增高，發(fā)病情況也愈加嚴(yán)重。

盡管寧夏賀蘭山東麓蒸發(fā)量大，有時(shí)降雨后并不能維持葉片的濕潤[17]，但夏季7—9月平均濕度達(dá)到了69%[18]，出現(xiàn)降雨時(shí)相對濕度大于80%，遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)霜霉發(fā)病的最低濕度。因此，降雨之后，應(yīng)盡快排水、通風(fēng)，保證葉片表面干燥，抑制霜霉菌侵染。同時(shí)，葉幕間疏密程度對霜霉病的發(fā)生也有一定的影響；越密集的葉片越易在降雨、灌溉后造成葉片間高濕的微氣候環(huán)境，最終導(dǎo)致霜霉病的發(fā)生[19-20]。因此，當(dāng)?shù)乜筛鶕?jù)病害發(fā)生情況，進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜~幕間管理，比如摘葉、打葉、修剪葉片薄厚程度等。

此外，不同釀酒葡萄品種對霜霉病的抗性不同[21]，‘霞多麗’‘美樂’‘品麗珠’等[22-23]品種均易發(fā)生霜霉病。本試驗(yàn)通過‘赤霞珠’和‘紫大夫’兩個(gè)品種進(jìn)行對比，為進(jìn)一步探究不同釀酒葡萄品種對霜霉病抗性差異奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明‘紫大夫’在低濕條件下更易發(fā)病；隨著濕度條件增高，‘赤霞珠’蔓延速度更快，程度更重。當(dāng)?shù)胤N植釀酒葡萄時(shí)，盡量不要選擇易感病品種或?qū)⒁赘胁∨c抗病品種嫁接種植。

通過在室內(nèi)和室外定時(shí)測定葉幕間的微氣候條件，得出葡萄霜霉病在室外濕度為75%的條件下，保濕6 h為霜霉病最早發(fā)病時(shí)間，但不排除保濕3 h時(shí)有潛在發(fā)病隱患，因此濕度為75%、保濕3 h應(yīng)為霜霉病發(fā)病的預(yù)警；當(dāng)達(dá)到這個(gè)條件時(shí)，應(yīng)提前噴施藥劑來抑制孢子囊的形成、萌發(fā)和侵染。