不同架式下‘桂葡6號’葡萄果皮中黃烷-3-醇組分分析

謝林君，張勁，周詠梅，謝太理，黃小云，成果*

（廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧 530007）

黃烷-3-醇類物質存在于很多植物的果實、葉片、果皮和種子中，可以使植物免受微生物、昆蟲和食草動物的傷害[1]。葡萄的黃烷醇類物質則主要分布在果皮、籽、果梗中[2-4]，有單體的形式及聚合體的形式，單體主要是表棓兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、兒茶素[(+)-catechin，C]、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin-gallate，ECG][5-6]。此外，黃烷醇類物質構成葡萄酒的基本骨架，是葡萄酒中重要的苦味及澀味物質；由于其易于被氧化，可以與花色苷發生反應生成穩定的復合產物，從而可以防止葡萄酒色素被氧化，保護葡萄酒顏色[7-8]。黃烷-3-醇類物質的組成和含量隨著果實的發育或者生長環境的變化而有所不同；當果實成熟度增加時，黃烷-3-醇類物質的聚合體（原花色素）含量及聚合度也逐漸增加[9-10]。

影響葡萄黃烷醇合成積累差異的因素主要包括內在因素和外在因素[11-12]。葡萄本身的遺傳特性構成其內在差異因素，黃烷醇含量和組成隨著不同葡萄品種而改變。環境因素是主要的外在因素，包括光照、溫度、降雨、栽培架式等。栽培架式的改變，則會形成不同的樹體結構，從而影響到植株的光合速率及生命活動[13]。不同的架式，既影響果實發育及最終產量，也影響果實組分，已有大量文獻對此報道[12]。選擇合適的葡萄架式，可以提高葡萄后期整體產量及果實品質[14-15]，還促進果實中風味物質的積累，釀出感官品質好的葡萄酒[16]。

‘桂葡6號’葡萄是廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所選育的優良釀酒品種[17]。目前國內外關于栽培架式對釀酒葡萄黃烷-3-醇類影響的研究主要集中于歐亞種，本研究團隊前期進行‘桂葡6號’果實黃烷-3-醇類組分特征影響的相關研究[18]，但關于不同栽培架式對‘桂葡6號’葡萄果皮中黃烷-3-醇類影響的研究尚未開展。本研究應用HPLC測定不同架式‘桂葡6號’葡萄果實發育過程中果皮中黃烷-3-醇成分及其含量的變化，為實際生產中通過栽培措施改良葡萄品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗區‘桂葡6號’葡萄于2010年3月種植，果園土質為黃壤土，株行距1.6 m×3.0 m，“V”形籬架栽培，樹勢中等，管理水平良好，田間土肥水管理和病蟲害防治等同常規。根據新梢和垂直立柱的夾角不同共設3個處理，0°單臂籬架；30°“V”形籬架；60°“V”形籬架。每種架式選擇樹體長勢基本一致的21株作為實驗樹，每7株合并作為一個生物學重復。

1.2 樣品采集與理化指標測定

樣品于花后4周（2017年9月28日）開始，每兩周采樣一次至采收期結束。每個處理采樣300粒，包含3個生物學重復（每個重復100粒），這些果粒來自于果穗的各部位，并立即用冰盒保存。其中150粒樣品（每個生物學重復50粒）用于測定果實鮮重、單粒果皮鮮重、可溶性固形物和可滴定酸含量。具體步驟為先將果實稱重，破碎取汁，分離果皮，吸水紙吸去多余水分后稱量果皮鮮重。其他樣品于-80 ℃冷凍備用。

可溶性固形物采用PAL-1型手持折射計（Atago,Tokyo, Japan）測定。可滴定酸用酸堿滴定法測定，結果以酒石酸表示。全部測定重復3次。

1.3 黃烷-3-醇類物質的檢測

黃烷-3-醇采取間苯三酚裂解法提取參照Liang等[19]的方法：取0.1 g葡萄皮干粉于10 mL離心管中，加入1 mL間苯三酚緩沖液和0.005 g抗壞血酸，于50 ℃下靜置裂解20 min，再加入1 mL乙酸鈉停止反應，離心15 min，取上清液于10 mL離心管中；重復3次，合并上清液搖勻，于-80 ℃冷凍備用。

檢測方法應用島津LC-20AD高效液相色譜參考成果等[18]方法對提取產物進行檢測。流動相A：0.2%乙酸水溶液。流動相B：乙腈∶0.2%乙酸水溶液=4∶1。流速：1.0 mL/min。柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：25 μL。

1.4 葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的定性與定量

通過表棓兒茶素、兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯標準品的保留時間對黃烷-3-醇進行定性，應用外標法，繪制這4種標準品的標準曲線進行定量。相關系數在0.97以上，結果以mg/kg表示。

1.5 試劑與標樣

標準品表棓兒茶素、兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯均為色譜級，購于Sigma（St. Louis, MO,USA）公司，純度為98%以上。色譜純乙腈、甲醇和乙酸均購于Fisher（Fairlawn, NJ, USA）公司，純度達99.9%以上；其余試劑均為分析純試劑。

1.6 數據處理

數據處理采用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL,USA）進行顯著性分析。繪圖采用Microsoft Excel 2010。

2 結果與分析

2.1 不同架式下‘桂葡6號’葡萄果實發育期理化指標變化情況

由圖1可以看出，3種架式下‘桂葡6號’葡萄果實發育期的粒質量、可溶性固形物和可滴定酸含量分別在各處理果實中的變化趨勢一致。葡萄粒質量隨著果實的發育逐漸上升，至10周后，增長趨勢減緩且變化不明顯（圖1A）。在12周時，單臂籬架處理和30°“V”形架處理粒質量顯著高于60°“V”形架，單臂籬架和30°“V”形架之間則無顯著性差異。如圖1B，果皮鮮重呈不斷上升的趨勢，在花后6周時，60°“V”形籬架的果皮鮮重顯著高于其它兩個架式。隨著果實發育期的變化，3個處理間的果皮鮮重差異不顯著，至采收時，單臂籬架的果皮鮮重最高，30°“V”形架次之，60°“V”形架的最低。圖1C所示，3個架式下的‘桂葡6號’葡萄的可溶性固形物含量在花后均呈現先慢后快的增長趨勢，在花后10周時，30°“V”形架、60°“V”形架顯著高于單臂籬架，但是在12周時，3個處理間差異不顯著。由圖1D可以看出，3種架式下‘桂葡6號’葡萄的可滴定酸含量則是呈現先上升后下降的趨勢，在花后10周時達最大值，此時，30°“V”形架和60°“V”形架的滴定酸含量顯著高于單臂籬架；至花后12周時，30°“V”形架中的滴定酸含量顯著高于其他兩個架式，而單臂籬架和60°“V”形架之間無顯著差異。

2.2 不同架式下‘桂葡6號’葡萄果實發育期果皮中黃烷醇總量及4種單體變化趨勢分析

由圖2A所示，不同架式下‘桂葡6號’葡萄果實發育期果皮中黃烷-3-醇總量變化趨勢基本一致，均呈先下降后上升的趨勢。在花后8周時，30°“V”形架果皮中黃烷-3-醇含量降至最低點，后緩慢上升。60°“V”形架則是在花后10周降至最低點，后緩慢上升。單臂籬架在花后8周時降至最低，至10周時，保持平穩；至12周時，緩慢上升。3個處理在花后8周至10周兩兩間均呈顯著差異。至花后12周，單臂籬架和30°“V”形架無顯著差異，且顯著高于60°“V”形架。在4種單體含量中，表棓兒茶素含量最高，表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯次之，兒茶素含量最低。如圖2B，在整個發育期中，果皮中表棓兒茶素含量與黃烷-3-醇總量變化趨勢一致，呈先下降后上升的趨勢；在花后10周時，3個處理間差異顯著，30°“V”形架表棓兒茶素含量最高，單臂籬架次之，60°“V”形架中的最低；而30°處理的最低點在花后8周，此時30°“V”形架處理的果皮中表棓兒茶素含量顯著低于60°“V”形架處理。待到花后12周時，單臂籬架處理和30°“V”形架處理無顯著差異，它們與60°“V”形架處理之間存在顯著差異。由圖2C可知，3個處理中果皮的兒茶素含量呈波動變化趨勢，單臂籬架處理呈波動上升的趨勢，30°“V”形架處理和60°“V”形架處理則呈先下降后上升趨勢。在花后12周時，單臂籬架處理和30°“V”形架處理之間無顯著性差異，且它們顯著高于60°“V”形架處理。圖2D所示，3種架式下的‘桂葡6號’葡萄皮中的表兒茶素含量先急速下降后緩慢上升，至花后12周時，0°處理其含量顯著高于30°“V”形架處理和60°“V”形架處理，后兩者間無顯著差異。由圖2E可知，表兒茶素沒食子酸酯的含量變化趨勢亦是先下降后略有上升，至花后12周時，3個處理之間存在顯著性差異，其中，30°“V”形架處理中含量最高，60°“V”形架處理次之，單臂籬架處理含量最低。

2.3 不同架式下‘桂葡6號’葡萄果皮中各組分占總量比例差異分析

如圖3所示，表棓兒茶素含量占黃烷-3-醇總量99%以上，其它3種單量之和占1%。3種架式下的‘桂葡6號’葡萄果皮中表棓兒茶素比例變化趨勢基本一致，花后10周和12周3個處理的表棓兒茶素比例無顯著差異。單臂籬架處理和30°“V”形架處理中兒茶素在花后10周達峰值，60°“V”形架處理則是在花后8周達峰值；3種架式下的兒茶素比例整體呈現先快速上升后趨穩的趨勢。表兒茶素比例則是隨著果實發育逐漸降低，至采收時略有回升，單臂籬架處理中的表兒茶素比例顯著高于30°“V”形架處理，60°“V”形架處理則與它們無顯著差異。表兒茶素沒食子酸酯在花后6周達峰值，之后呈下降趨勢，待采收期略有回升，單臂籬架處理顯著低于30°“V”形架處理和60°“V”形架處理。采收期時，30°“V”形架處理和60°“V”形架處理的表兒茶素沒食子酸酯顯著高于單臂籬架處理。

2.4 不同架式下‘桂葡6號’葡萄果皮中3',5'-羥基和3'-羥基取代黃烷-3-醇比例

將黃烷-3-醇按其B環羥基化程度不同分類，可分為3',5'-羥基化和3'-羥基化兩種。本研究結果表明，3種架式下的‘桂葡6號’葡萄果皮中所含有的黃烷-3-醇以3',5'-羥基化修飾為主，且3',5'-羥基化黃烷-3-醇比例隨發育期呈波動上升趨勢，而3'-羥基化黃烷-3-醇比例持續降低。花后6周時，3種架式下的‘桂葡6號’葡萄果皮中3',5'-羥基化黃烷-3-醇存在顯著差異，單臂籬架處理的含量最高，30°“V”形架處理次之，60°“V”形架處理最低。隨后，這種差異逐漸縮小，至花后10周時，3個處理間無顯著差異。而3種架式下的‘桂葡6號’葡萄果皮中所含有的3'-羥基化黃烷-3-醇在花后6周時達最大值，其中，單臂籬架處理的3'-羥基化黃烷-3-醇含量最低，30°“V”形架處理次之，60°“V”形架處理的含量最高。至花后8周時，3'-羥基化黃烷-3-醇含量急速下降，之后小幅波動。花后12周時，3個處理間無顯著差異，但單臂籬架處理和60°“V”形架處理的3'-羥基化黃烷-3-醇含量高于30°“V”形架處理。

3 討論

葡萄果皮中常見的黃烷-3-醇類物質有表棓兒茶素、兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯4類[20-21]。‘桂葡6號’葡萄果實生長發育過程中，果皮黃烷-3-醇類物質含量在花后6周時達到最高，在轉色過程中大幅度下降，之后含量變化趨勢較為平緩。果皮中黃烷-3-醇類物質在轉色后發生氧化和降解作用[22-23]，同時，大部分黃烷-3-醇隨著果實的發育形成聚合體與細胞壁上的多糖和蛋白結合[24]，從而使葡萄轉色后果皮中黃烷-3-醇類物質含量顯著降低[25-26]。

將黃烷-3-醇按其B環羥基化程度不同分類，可分為3',5'-羥基化和3'-羥基化兩種。由F3'H催化產生的二羥基化（3'-羥基取代）黃烷-3-醇主要有兒茶素和表兒茶素；由F3'5'H催化產生的三羥基化（3',5'-羥基取代）黃烷-3-醇主要有棓兒茶素和表棓兒茶素[16]。本研究中，‘桂葡6號’葡萄果皮中總黃烷醇含量的變化趨勢與表棓兒茶素相似，這主要是因為表棓兒茶素在葡萄果皮黃烷醇中占有最高的比例，這與先前該品種的研究結果一致[18]。

表兒茶素與兒茶素雖然只是在C3位的構象不同，但卻有截然不同的口感，表兒茶素比兒茶素更加苦澀而且苦澀感覺持續的時間也更長[27]。本研究中，單臂籬架處理果皮中表兒茶素含量在采收期顯著高于30°“V”形架和60°“V”形架處理，后兩者間無顯著差異。這說明，單臂籬架處理‘桂葡6號’果實苦澀感比其它兩個處理更強。黃烷-3-醇C3位的羥基基團容易被沒食子酸酯化，沒食子酸酯化使酒的單寧感變粗糙，而三羥基化黃烷醇能夠降低這種粗糙的口感，柔順酒體[28-30]。本研究中，單臂籬架處理葡萄果皮中表兒茶素沒食子酸酯的含量和比例在采收期均顯著低于其他兩個處理，30°“V”形架處理葡萄果皮中黃烷-3-醇總量和三羥基化黃烷醇的比例最高。由以上分析可以看出，單臂籬架處理可能使后期的葡萄酒單寧粗糙，而30°“V”形架處理有助于提高葡萄酒的柔順度。

4 結論

本試驗研究不同架式對‘桂葡6號’葡萄果皮黃烷-3-醇含量及組分的影響，從提升葡萄酒柔順度和改善口感的角度考慮，生產上建議‘桂葡6號’選擇30°“V”形籬架的整形方式。然而當前缺乏不同架式處理下黃烷-3-醇變化對‘桂葡6號’葡萄酒口感影響的研究，后續將逐步開展，以期為進一步找到適宜的栽培管理措施、改善葡萄酒品質提供理論依據。