青花菜BoDof5.3基因的克隆及漬水脅迫表達(dá)特征分析

裴徐梨 荊贊革 徐境 唐征 宋波

摘要：從青花菜中克隆得到一個(gè)Dof基因，命名為BoDof5.3。序列分析結(jié)果表明：該基因ORF全長(zhǎng)774 bp，編碼257個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。青花菜BoDof5.3蛋白具有典型的Zf-Dof結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，青花菜BoDof5.3蛋白與甘藍(lán)、花椰菜Dof蛋白親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹(shù)上聚為一組， 同屬植物的Dof蛋白具有較近的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在漬水脅迫0 d到2 d時(shí)，BoDof5.3基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，6 d時(shí)表達(dá)量升高為對(duì)照的1.3倍，推測(cè)該基因可能參與青花菜漬水脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：青花菜;Dof基因;基因克隆;漬水脅迫;表達(dá)特征

中圖分類號(hào)：S635.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）06-1498-05

Abstract：In this study， a Dof gene named BoDof5.3 was cloned from broccoli. Sequence analysis results showed that this gene was 774 bp in length， which encoded 257 amino acids. Furthermore， the protein encoded by this gene was a hydrophilic protein. The BoDof5.3 contained a typical Zf-Dof domain， and its main secondary structure was the random coil. Results of phylogenetic analysis indicated that the BoDof5.3 protein of broccoli had the highest homology with the Dof protein of cabbage and cauliflower， and they were clustered into a group on phylogenetic tree. Furthermore， the Dof protein in the same genus had close relationship. The results of qRT-PCR showed that the expression level of BoDof5.3 decreased from 0 d to 2 d under waterlogging stress， and the expression level at six days of waterlogging stress was 1.3 times as much as that of control. It is speculated that BoDof5.3 gene may be involved in the response of broccoli to waterlogging stress.

Key words：Brassica oleracea var. italica;Dof gene;gene clone;waterlogging stress;expression feature

Dof（DNA binding with one finger）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其在N-末端具有長(zhǎng)度為52 aa的Dof結(jié)構(gòu)域，可與DNA結(jié)合，同時(shí)還可進(jìn)行蛋白-蛋白互作。C-末端的可變結(jié)構(gòu)域可在不同的代謝途徑中產(chǎn)生多樣的調(diào)控功能[1-2]。目前Dof基因已在擬南芥、水稻、大豆、大麥、紅花、玉米等多種植物中成功克隆[3-8]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，Dof基因廣泛參與碳氮代謝、開(kāi)花、花和花粉發(fā)育、保衛(wèi)細(xì)胞特異基因的調(diào)控、防御反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程。在檉柳中，20個(gè)ThDof基因參與了脅迫應(yīng)答。過(guò)表達(dá)ThDof16基因可明顯提高植株抗干旱和高鹽脅迫 [9]。在鹽脅迫條件下，過(guò)表達(dá)紅花CtDof1基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性[7]。Hennig等在研究擬南芥Dof蛋白OBP1時(shí)發(fā)現(xiàn)，該蛋白可通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶6的表達(dá)來(lái)對(duì)植物激素和脅迫信號(hào)作出響應(yīng)[10]。

青花菜（Brassica oleracea var.italica）與花椰菜、甘藍(lán)同屬甘藍(lán)類蔬菜，以小花蕾和嫩花莖為產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)豐富。其喜溫暖濕潤(rùn)，但不耐澇。浙江省地處東部沿海，每年8-9月常受臺(tái)風(fēng)和特大暴雨影響，青花菜育苗和定植期間易遭淹水而大面積死苗，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示BoDof5.3基因在高溫和鹽脅迫條件下表達(dá)量可發(fā)生較大變化。因此，本試驗(yàn)通過(guò)克隆青花菜BoDof5.3基因，并對(duì)其特性、同源進(jìn)化樹(shù)以及在漬水脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析，以期為研究該基因的功能及其參與漬水脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以青花菜WN12-95為材料，種植于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為25 ℃/16 h（白天）～18 ℃/8 h（晚上）。待植株長(zhǎng)至5葉期時(shí)開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行漬水脅迫處理，處理時(shí)間為0 d、2 d和6 d，每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2RNA的提取和cDNA的合成

葉片經(jīng)液氮冷凍后迅速研磨成粉末，用于RNA的提取。總RNA提取使用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品），cDNA的合成采用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）。產(chǎn)物置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

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（責(zé)任編輯：張震林）