液相色譜法測定蔬菜中3種氨基甲酸酯類農藥殘留量的不確定性評價

劉順字 韓文節 歐志鵬 華四妹 郭淑貞 廖遠東 林雙娣

摘要：采用液相色譜法檢測蔬菜中殘留的3種氨基甲酸酯類農藥，對方法中的主要不確定度來源進行量化，計算總不確定度和擴展不確定度。結果表明，液相色譜法檢測3種氨基甲酸酯類農藥的相對標準不確定度分量（Urel）均表現出Urel標準品（總）>Urel回收率>Urel樣品>Urel儀器的規律。研究結果為檢測蔬菜中的氨基甲酸酯類農藥殘留提供了參考。

關鍵詞：液相色譜法;氨基甲酸酯類農藥;蔬菜;不確定度

中圖分類號：S482.3+4文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1569-06

Abstract：Liquid chromatography method was applied to detect the residues of three carbamate pesticides in vegetables， the sources of main uncertainties were quantified， and the total uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the relative standard uncertainty components （Urel） of three carbamate pesticides all presented the rule of UrelStandard sample（total）>UrelRecovery rate>UrelSample>UrelInstrument. The results provide a references for analyzing the residues of carbamate pesticides in vegetables.

Key words：liquid chromatography method;carbamate pesticides;vegetable;uncertainty

在檢測蔬菜中的農藥殘留時，實驗室采用的檢測方法會直接影響檢驗、檢測報告的質量，因此在實驗室初次選用標準或非標準方法開展檢測時，通常需要對選定的方法進行確認[1]。在使用非標準方法或某些標準方法進行檢測時，還需要進行不確定度的評估[2]，通過評估不確定度可以量化主要不確定因子與檢測結果的范圍[3]。由此可見，評價測量的不確定度是保障實驗室檢測結果質量的重要手段之一[4]。

液相色譜儀在市（縣）級農產品檢測機構中的應用較為廣泛，主要用于測定蔬菜、水果中氨基甲酸酯類農藥的殘留情況，是農產品檢測機構使用的重要檢測儀器之一[5-6]。本研究通過評定不確定度的基本方法，分析不確定度分量的因素與其對檢測結果的影響程度[7-8]，以期為正確評價和使用測量結果提供試驗依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料為四九菜心，購自中振智農科技有限公司。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器液相色譜儀（LC-20A， RF-20Axs），產自日本Shimadzu公司;勻漿機（T18DS25），產自德國IKA公司;高速離心機（TDL-5-A），產自上海安亭科學儀器廠;氮吹儀（N-EVAP-112），產自美國Organomation公司;萬分之一電子分析天平（JJ-124BC），產自常熟市雙杰測試儀器廠;1 000 ml砂芯過濾裝置，產自天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2.2試劑滅多威、甲萘威、克百威標樣均由原農業部環境保護科研監測所提供，質量濃度均為100μg/ml，溶劑均為甲醇。乙腈（99.99%）、甲醇（99.99%）與二氯甲烷（99.9%）均為色譜純，產自Honeywell;NaOH為優級純，產自廣州化學試劑廠;硼酸為優級純，產自廣州化學試劑廠;99%鄰苯二甲醛，產自PICKERING;巰基乙醇，產自株式會社同仁化學研究所;SPE-NH2固相萃取小柱，產自Shimadzu。除試驗用水為超純水外，其他試驗試劑均為分析純。

1.3試驗方法

1.3.1提取與凈化用200 ml燒杯稱取25.000 0 g解凍的菜心鮮樣，再向燒杯中倒入50.0 ml乙腈，用勻漿機在燒杯中高速勻漿2 min后，將混合物倒入三角漏斗中進行過濾，濾液用裝有6.0 g氯化鈉的具塞量筒全部收集。過濾后，雙手劇烈搖晃具塞量筒1 min，然后將其靜置30 min，取上清液10.0 ml轉移至玻璃試管內，用氮吹儀在50 ℃恒溫水浴條件下緩慢吹至近干狀態，再用2.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液（體積比為1∶99）溶解試管內的殘渣，將溶解物上樣至固相萃取小柱中進行凈化，用10.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液（體積比為5∶95）分2次洗脫，將全部洗脫液用液氮吹至近干。用甲醇（99.99%）定容至2.0 ml，再用注射器將溶液緩慢通過孔徑為0.22 μm的濾膜，收集適量過濾后的溶液于樣品瓶內待上機檢測[9-10]。

1.3.2色譜條件色譜柱采用WondaSil C18-WR 5 μm（4.6 mm×250.0 mm），流動相為水-甲醇（體積比為4∶1），流速為1.0 ml/min，柱溫為50 ℃。溶劑的梯度洗脫過程：15%甲醇0.01 min→20%甲醇4.00 min→35%甲醇11.00 min→70%甲醇31.00 min→90%甲醇31.01 min→70%甲醇34.00 min→15%甲醇34.01 min→15%甲醇40.00 min，停止。

2結果與分析

2.1數學模型的建立[11]

（1）檢測3種氨基甲酸酯類農藥在菜心中的殘留量所用的數學模型為：

式中：X為鮮樣中的農藥含量（mg/kg），C為由標準曲線校正后試樣中農藥的質量濃度（mg/L），V為樣品的定容體積（ml），m為鮮樣質量（g），f為稀釋因子。

（2）根據相對標準不確定度分量計算總相對標準不確定度，公式[12]為：

式中：Urelyi為總相對標準不確定度，Urelxi為各分量的相對標準不確定度，N為分量數。

（3）儀器按最小二乘法擬合工作曲線，計算標準曲線的標準差，公式為：

式中：SA為標準曲線的標準差，yi為第i次測得的色譜峰面積，a為曲線截距，b為曲線斜率，ci為第i次根據標準曲線計算得到的濃度，n為標準溶液的總測量次數。

（4）曲線擬合相對標準不確定度（UrelQ）計算公式為：

式中：SA為標準曲線的標準差，p為樣品的測量次數，n為標準溶液的總測量次數，b為標準曲線的斜率，c1為通過標準曲線計算出的樣品溶液濃度均值， c-為各標準系列溶液濃度的平均值，ci為第i次根據標準曲線計算得到的濃度。

2.2平行試驗結果

在菜心基質對照中分別按1.00 mg/kg的質量分數加入滅多威、甲萘威、克百威3種標樣，共設6個重復。由表1可以看出，基質中滅多威、甲萘威、克百威的平均測定值（最佳估計值）分別為0.952 mg/kg、0.885 mg/kg、0.920 mg/kg。

2.3不確定度評價

在實驗室數學模型的建立與分類過程中，檢測樣品（菜心）中農藥殘留量所用的主要不確定度來源見表2。

2.3.1由標準品引起的不確定度

2.3.1.1由標準物質本身引起的不確定度滅多威、甲萘威、克百威3種農藥標準溶液的偏差統一為±0.5%。根據均勻分布分析得出，置信因子（k）=3=1.732，3種農殘標準品的Urel標=0.5%/1.732=0.002 89。

2.3.1.2在標準品與標準曲線制作過程中由玻璃器皿產生的不確定度（1）容量瓶與移液管自身產生的不確定度。由檢定證書可知容量瓶（容積為10 ml）的最大誤差是±0.10 ml，移液管（容積為1 ml）的最大誤差是±0.007 ml，根據均勻分布計算得到相對標準不確定度[13]：

U容量瓶=0.1/3=0.057 7 ml，Urel容量瓶=0.057 7 ml/10 ml=0.005 77（自由度為∞）;

U移液管=0.007/3=0.004 04 ml，Urel移液管=0.004 04 ml/1 ml=0.004 04（自由度為∞）。

（2）環境溫度對容量瓶與移液管量取溶液時產生的不確定度。實驗室的溫度一般控制在（20±5） ℃[14]。乙腈膨脹系數為1 ℃ 1.36×10-3，玻璃器皿膨脹系數為1 ℃ 2.50×10-5，由于乙腈膨脹系遠遠大于玻璃器皿，因此忽略溫度對玻璃器皿產生的膨脹影響，僅以溫度造成的乙腈體積變化進行計算[15]。溫度對容量瓶與移液管2個玻璃器皿量取溶液時的不確定度分別為：

Ut-容量瓶=10×5×1.36×0.001/3=0.039 3 ml，Urel t-容量瓶=0.039 3 ml/10 ml=0.003 93 （自由度為∞）;

U t-移液管=1×5×1.36×0.001/3=0.003 93 ml，Urel t-移液管=0.003 93 ml/1 ml=0.003 93 （自由度為∞）。

根據矩形分布[16]和公式（2）可得玻璃器皿總相對標準不確定度（Urelgla）為0.008 97。

2.3.1.3標準曲線擬合的不確定度對不同質量濃度的標準溶液系列做6個水平的檢測，采取最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-色譜峰面積曲線[17]，相關數據見表3。由最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-色譜峰面積可得，滅多威、甲萘威、克百威的線性回歸方程分別為Y1=4 970.2x1+5 105.4 （R2=0.999 9）、Y2=4 255.6x2+6 399.5 （R2=0.999 9）、Y3=2 606.2x3+2 696.8 （R2=0.999 8）。根據公式（3）可得滅多威、甲萘威、克百威的標準偏差分別為11 524.45、7 989.27、6 718.38。根據公式（4）可得滅多威、甲萘威、克百威的相對標準不確定度（Urelcur）分別為0.017 6、0.015 7、0.020 2。

由標準物質本身引起的不確定度，在標準品與標準曲線制作過程中由玻璃器皿產生的不確定度（Urelgla），由標準曲線擬合造成的不確定度是標準品物質產生總相對不確定度Urel標（總）的來源[18]，依據公式（2）（Urel標（總）=Urel2標+Urel2gla+Urel2cur），由滅多威、甲萘威、克百威的3種標準品產生的總相對不確定度（Urel標（總））依次是0.021 6、0.020 2、0.023 8。

2.3.2重復檢測引起的不確定度樣品的質量濃度通過儀器讀數獲取，由于用儀器重復檢測樣品時的峰面積存在差異，因此采用標準不確定度的A類評定法，即根據重復次數獲得不確定度[19]。將3種農藥標準品配成合適的質量濃度后重復檢測6次，測定結果見表4。

根據JJF 1059-1999《測量不確定度評定與表示》，本試驗僅檢測6次，并根據極差法開展不確定度的評定[20]。查閱《極差系數及自由度表》可得：測量次數（n）=6，極差系數（C）=2.53，A-為6次檢測峰面積的平均值。滅多威的標準不確定度（U儀）=R/C=65/2.53=25.69，重復檢測滅多威的相對標準不確定度（Urel儀）= U儀/A-=25.69/93 638=0.000 274。同理，重復檢測甲萘威、克百威的相對標準不確定度（Urel儀）分別為0.000 313、0.000 515。

2.3.3樣品處理產生的不確定度稱取樣品用的天平與凈化定容的玻璃器皿是制備樣品過程中產生不確定度的2個主要因素[21]。本研究中精度為0.000 1 g的天平最大誤差范圍是±0.01 mg，置信區間為99%。在方法1.3.1中，樣品的稱取質量為25.000 0 g，根據正態分布分析可知，置信因子（k）為2.576[22]。移液管的不確定度參照方法2.3.1.2測定[23]，樣品處理過程中的不確定度見表5。根據公式（2），3種樣品處理過程中引起的總相對標準不確定度（Urel樣）為0.004 294。

2.3.4結果分析產生的不確定度回收率是結果分析中產生不確定度的重要來源[24]，本試驗采取0.010 mg/kg、0.050mg/kg、0.100 mg/kg 3個質量濃度檢測滅多威、甲萘威、克百威3種農藥的殘留回收率的相對標準不確定度（Urel回），每個濃度設6次重復，結果見表6 [25]。采用標準不確定度的A類評定法檢測本試驗的回收率[26]，得到滅多威的U回=3.9/18=0.92，Urel回=0.92/87.5=0.010 5;同理，甲萘威、克百威的Urel回分別為0.011 6、0.011 3。

2.4總相對標準不確定度

試驗全程產生的方法不確定度因子有4個，即標準品、儀器、樣品與回收率[27]。根據表7中的分量與公式（2） [28]，得到總相對標準不確定度（UrelT）的計算公式：UrelT=Urel2標（總）+Urel2儀+Urel2樣+Urel2回，其中滅多威的UrelT= 0.024 4，甲萘威的UrelT=0.023 7，克百威的UrelT=0.026 7。

2.5總擴展不確定度

在95%置信水平下，包含因子（k）=2，可得相對擴展不確定度（u）=UrelT×k[29]。根據2.2節中3種農藥的最佳估計值，計算得到的擴展不確定度見表8。

3討論

根據上述分析可知，滅多威、甲萘威、克百威3種殘留量的擴展不確定度（置信水平為95%）分別為0.004 6 mg/kg、0.004 2 mg/kg、0.004 9 mg/kg。在本方法中，滅多威、甲萘威、克百威3種農藥殘留量的相對標準不確定度分量呈現的趨勢為Urel標>Urel回>Urel樣> Urel儀。分析相對標準不確定度分量對總相對標準不確定度的影響，有利于今后在檢測過程中有針對性地降低結果的不確定度。

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（責任編輯：徐艷）