雞爪槭ApMYB306基因克隆及功能分析

朱璐 李淑順 聞婧 馬秋月 顏坤元 任杰 李倩中

摘要：采用基因克隆的方法獲得雞爪槭金陵黃楓R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，經(jīng)同源比對和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。通過組織表達特性分析發(fā)現(xiàn)ApMYB306在莖中表達量最高，葉中表達量次之，根中表達量最低。在洋蔥表皮細胞中瞬時表達分析結(jié)果顯示ApMYB306蛋白定位于細胞核中。ApMYB306對于高溫、低溫、干旱和鹽脅迫均有明顯的響應(yīng)，受脅迫誘導(dǎo)后表達量顯著上升。冷凍處理后，轉(zhuǎn)ApMYB306基因株系成活率較野生型升高。ApMYB306超表達擬南芥株系較野生型開花延遲，表明ApMYB306可能通過抑制擬南芥FT基因啟動子的表達調(diào)控花期。

關(guān)鍵詞：雞爪槭;ApMYB306基因;抗逆性

中圖分類號：S687文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1512-09

Abstract：In this study， the R2R3-MYB transcription factor gene was obtained from Acer palmatum Jinlinghuangfeng by gene cloning and named ApMYB306 via homology comparison and bioinformatics analysis. Through the analysis of tissue expression characteristics， it was found that the expression level of ApMYB306 was the highest in the stem， followed by leaves， and the expression level was lowest in the roots. The results of transient expression analysis in onion epidermal cells showed that ApMYB306 protein was localized in the nucleus. ApMYB306 had obvious response to high temperature， low temperature， drought and salt stress， and its expression level increased significantly after induction. After freezing treatment， the survival rate of ApMYB306 transgenic lines was higher than that of the wild-type lines. The flowering time of ApMYB306 overexpressing Arabidopsis lines was later than that of the wild-type lines， which indicated that ApMYB306 might regulate the flowering time by inhibiting the expression of the FT gene promoter.

Key words：Acer palmatum;ApMYB306 gene;stress resistance

雞爪槭（Acer palmatum Thunb.）為槭樹科槭屬植物，其葉色豐富，葉形優(yōu)美，是中國極為重要的彩葉樹種，具有很高的觀賞價值，在彩葉苗木生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1]。在雞爪槭苗木栽培和生產(chǎn)過程中，干旱、鹽脅迫、寒害和熱脅迫等非生物脅迫是制約雞爪槭生產(chǎn)和園林應(yīng)用的關(guān)鍵因素，因此挖掘雞爪槭抗性基因，解析其調(diào)控機制，可為獲得優(yōu)良抗性的雞爪槭品種及其分子遺傳育種提供重要基礎(chǔ)。

MYB轉(zhuǎn)錄因子大家族包括3個亞類，即MYB1R、R2R3-MYB和MYB3R。其中，植物中最大的亞類是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。例如，模式植物擬南芥具有126個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[3]，而玉米的基因組則具有173個[4]，蘋果具有222個[5]，番茄具有121個[6]，黑楊木具有192個[7]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子功能繁多，參與調(diào)控植物初生和次生代謝反應(yīng)、植物生長發(fā)育及生物和非生物脅迫等過程。例如，蘋果MdMYB23受冷脅迫誘導(dǎo)。MdMYB23超表達的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥耐寒性增強[8]。水稻OsMYB2在鹽、冷和干旱脅迫下表達增強，超表達植株比野生型對鹽、冷和干旱脅迫的耐受性更強[9]。而在擬南芥中，AtMYB30、AtMYB60和AtMYB96（亞家族1）[10-12]，AtMYB13和AtMYB15（亞家族2）[13]，AtMYB102和AtMYB41（亞家族11）[14-15]，AtMYB33和AtMYB101（亞家族18）[16]，AtMYB2、AtMYB62和AtMYB108（亞家族20）[17]，AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77（亞家族22）[18-19]等均參與調(diào)控生物和非生物脅迫響應(yīng)途徑。菊花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CmMYB2不僅參與非生物脅迫應(yīng)答，還參與調(diào)控菊花和擬南芥開花[19-20]。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列克隆雞爪槭R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其基因和編碼的氨基酸序列進行比對分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對其基因在不同組織和非生物脅迫下的表達進行分析，為進一步研究雞爪槭R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫和開花機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料及處理方式

供試雞爪槭品種金陵黃楓種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院槭樹良種基地。取當(dāng)年生新鮮枝條作為外植體，通過組織培養(yǎng)快繁獲得無菌幼苗，將幼苗練苗并移栽到穴盤中培養(yǎng)。取生長一致的約10 cm左右的幼苗用于低溫（4 ℃）處理和高溫（40 ℃）處理。將組織培養(yǎng)獲得的幼苗在Hoaglands營養(yǎng)液中水培，取生長一致的約10 cm左右的幼苗用于鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）處理和干旱（20% PEG6000）處理。4種非生物脅迫處理均以上午9∶00為0 h，分別在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h和24 h取樣。低溫處理和高溫處理取樣部位為第3和第4片完全展開葉，鹽脅迫處理和干旱處理取樣部位為不定根，每個處理3個重復(fù)。未處理的穴盤苗和水培小苗植株，取其根、莖和葉片，立即放入液氮中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫總€組織3個重復(fù)。將3周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系置于光照培養(yǎng)箱（Sanyo，MIR-154）4 ℃處理24 h，-9 ℃處理6 h后，轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)條件的光培箱培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計觀察成活率。培養(yǎng)條件為光周期16 h/8 h（光照/黑暗），溫度22 ℃/18 ℃，光照度200 μmol/（m2·s），相對濕度為70%。

1.2總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取使用Trizol（TaKaRa， Tokyo， Japan）提取法，使用RNase-free DNase I（TaKaRa公司產(chǎn)品）去除基因組DNA。取1 μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄獲得cNDA備用。

1.3雞爪槭金陵黃楓ApMYB306基因克隆及表達載體構(gòu)建

從雞爪槭轉(zhuǎn)錄組庫（SRX833686 ULRs： http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中查找獲得雞爪槭ApMYB306 cNDA全長序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計ApMYB306全長引物和RT-PCR引物。利用高保真酶Ex Taq（TaKaRa公司產(chǎn)品）進行PCR擴增獲得ApMYB306 cNDA全長序列，將擴增產(chǎn)物連接pMD19-T載體（TaKaRa公司產(chǎn)品）進行測序，獲得ApMYB306在雞爪槭金陵黃楓中的cNDA全長序列。將ApMYB306開放閱讀框（ORF）使用含有酶切位點BamH I和Not I序列的引物擴增，同時使用BamH I和Not I對擴增產(chǎn)物和pENTR1A（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）進行雙酶切。將酶切后的產(chǎn)物回收并利用連接酶T4 DNA ligase（TaKaRa公司產(chǎn)品）進行連接，獲得載體pENTR1A-ApMYB306。將該載體進行單酶切，使之線性化，通過LR（LR ClonaseTM II enzyme system，Invitrogen）重組構(gòu)建到pMDC43載體[21]上，最終獲得載體pMDC43-ApMYB306，提取質(zhì)粒-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ApMYB306序列比對和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

從GenBank下載ApMYB306同源蛋白質(zhì)氨基酸序列，與ApMYB306氨基酸序列共同使用ClustalW軟件進行多重比對分析[22]。使用MEGA 7.0軟件，基于Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5ApMYB306亞細胞定位

通過基因槍（PDS-100， Bio-Rad， Hercules， CA， USA）轟擊洋蔥表皮細胞，將2 μg質(zhì)粒pMDC43-ApMYB306和pMDC43空載（對照）分別瞬時轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細胞。將轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細胞在MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基上23 ℃暗培養(yǎng)16 h，通過激光共聚焦顯微鏡（LSM800， Zeiss， Germany）觀察GFP蛋白的表達情況。

1.6ApMYB306基因表達分析

利用熒光定量PCR技術(shù)對ApMYB306基因進行表達分析，使用ApActin基因（MN026864）作為內(nèi)參基因。每個qPCR體系終體積為20.0 μl，均由10.0 μl SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司產(chǎn)品），0.4 μl上游和下游引物（10 μmol/L）（F：5′-TGTCCCCTGAAAAACCAAATA-3′;R：5′-TTCCTCCCCCATCAGCAAA-3′），5.0 μl模板cDNA（1 ng/μl）和0.4 μl ROX組成。使用Real Time PCR熒光定量儀（Applied Biosystems 7500， Carlsbad， CA， USA）進行相對實時熒光定量PCR。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s 40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s[23]。使用2-△△Ct方法計算相對表達量，每個反應(yīng)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.7轉(zhuǎn)ApMYB306基因擬南芥

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pMDC43-ApMYB306轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，利用蘸花法侵染擬南芥花序，在含有潮霉素（Hygromycin）的培養(yǎng)基上篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系。選擇2個獨立的轉(zhuǎn)基因株系用于表型分析。

1.8ApMYB306與擬南芥AtFT啟動子結(jié)合性試驗

將1.0 kb的AtFT啟動子構(gòu)建到pCAMBIA1381-LUC載體，與pMDC43-ApMYB306分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，將含有陽性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和增強表達菌株P(guān)19培養(yǎng)至OD值1.5左右。然后離心，收集菌體，將菌體使用侵染緩沖液[10 mmol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、50 mmol/L MgCl2和100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）]重懸。根據(jù)試驗要求將含有不同載體的菌液混合，同時在每一個組合中添加菌株P(guān)19。將混合后的菌液離心，黑暗靜止3 h，然后注射煙草葉片。注射后的煙草暗培養(yǎng)1 d，光培養(yǎng)2 d后摘下侵染葉片，在背面噴施熒光素酶（LUC）底物甲蟲熒光素（Beetle luciferin），暗處理5 min，使用天能化學(xué)發(fā)光儀器5200Multi進行曝光拍照。

1.9數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 19.0進行統(tǒng)計整理及分析，差異顯著性采用ANOVA分析，Duncans檢驗（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1ApMYB306基因堿基序列

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的序列設(shè)計全長特異引物，以雞爪槭金陵黃楓cDNA為模板，利用高保真酶PCR技術(shù)獲得一個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的全長序列，通過同源比對和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。ApMYB306開放閱讀框（ORF）具有1 065 bp，編碼一條355個氨基酸殘基的多肽。推測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為3.967×104，理論等電點為6.35。將ApMYB306基因編碼的氨基酸序列在NCBI站點進行BLASTp比對，發(fā)現(xiàn)ApMYB306編碼的氨基酸序列與龍眼（Dimocarpus longan）MYB22基因（Accession Number：QCH41134.1）、柑桔（Citrus macrophylla）MYB60基因（Accession Number：ABK59039.1）、小柑桔（Citrus clementina）MYB306基因（Accession Number：XP_006431144.1）、葡萄（Vitis vinifera）MYB306基因（Accession Number：XP_002283575.1）、榴蓮（Durio zibethinus）MYB306基因（Accession Number：XP_022751922.1）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）MYB306基因（Accession Number：XP_021297573.1）和可可（Theobroma cacao）MYB306基因（Accession Number：XP_007032529.1）編碼的氨基酸序列進行比對（圖1），同源性依次為78.99%、67.5%、65.57%、66.95%、65.66%、67.80%、67.80%。ApMYB306蛋白分別在14～63 aa和67～111 aa處含有2個MYB結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。另外將ApMYB306蛋白氨基酸序列與其他物種中的同源序列進行多重比較，并進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。從系統(tǒng)進化樹中可以看出ApMYB306與龍眼DlMYB22親緣關(guān)系最近，推測其可能具有類似的功能（圖2）。

2.2ApMYB306基因組織表達特性及定位

取雞爪槭幼苗根、莖和葉提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析ApMYB306基因在不同組織中的表達。結(jié)果表明，ApMYB306基因在莖中表達量最高，葉片次之，根中表達量最低（圖3）。

為了檢測ApMYB306蛋白的亞細胞定位情況，本研究在洋蔥表皮細胞中瞬時表達了p35S：：GFP-ApMYB306。結(jié)果表明ApMYB306蛋白在細胞核中積累。同時，在整個細胞中都觀察到了陽性對照p35S：：GFP瞬時表達產(chǎn)生的GFP信號（圖4）。

各氨基酸來源及序列登錄號為：DlMYB22（龍眼QCH41134.1）、CmMYB60（柑桔ABK59039.1）、CcMYB306（小柑桔XP_006431144.1）、VvMYB306（葡萄XP_002283575.1）、DzMYB306（榴蓮XP_022751922.1）、HuMYB306（哥倫比亞錦葵XP_021297573.1）和TcMYB306（可可XP_007032529.1）。

2.3ApMYB306基因在不同脅迫處理下的表達

2.3.1ApMYB306基因在低溫和高溫脅迫下的表達如圖5所示，ApMYB306基因表達受低溫（4 ℃）和高溫（40 ℃）誘導(dǎo)。ApMYB306基因在低溫和高溫條件下，表達量均在24 h內(nèi)持續(xù)升高，并在24 h表達量達到最高值，分別是0 h表達量的8.9倍和5.8倍，表明ApMYB306基因受低溫和高溫脅迫顯著誘導(dǎo)。

2.3.2ApMYB306基因在鹽和干旱脅迫下的表達如圖6所示，在200 mmol/L NaCl處理下，ApMYB306基因被迅速誘導(dǎo)表達，在處理8 h后，ApMYB306表達量達到最高值，是0 h表達量的3.1倍，隨后表達量略有降低，但仍高于對照。ApMYB306基因在20% PEG6000模擬干旱條件下，表達量迅速升高，并在處理8 h后ApMYB306表達量達到最高值，隨后逐漸降低，表明ApMYB306基因受鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)顯著。

2.4ApMYB306超表達擬南芥的抗凍性和開花期變化

將獲得的ApMYB306超表達擬南芥陽性株系進行篩選和鑒定，選取表達量最高的2個獨立株系用于后續(xù)功能鑒定。如圖7所示，對野生型和ApMYB306超表達擬南芥株系（35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2）進行冷凍處理后，ApMYB306超表達擬南芥株系較野生型成活率明顯升高。推測ApMYB306基因提高了擬南芥的抗凍性。

對ApMYB306超表達擬南芥株系（35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2）進行表型觀測發(fā)現(xiàn)，ApMYB306超表達擬南芥較野生型擬南芥開花延遲（圖8）。野生型擬南芥在播種后（36.6±1.2） d開花，而35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2則分別在播種后（42.3±1.5） d和（41.5±1.1） d開花（圖8b）。測量野生型和ApMYB306超表達擬南芥株系的蓮座葉數(shù)量，發(fā)現(xiàn)野生型蓮座葉數(shù)量為12.2±0.9，而35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2蓮座葉數(shù)量多于野生型，分別為16.1±1.2和15.7±1.1（圖8c）。對開花關(guān)鍵基因AtFT和AtFLC的表達進行熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)AtFT的表達量在ApMYB306超表達擬南芥株系中明顯降低（圖8d），AtFLC的表達量則無明顯變化（圖8e）。

將擬南芥AtFT 1.0 kb長度的啟動子序列構(gòu)建到無啟動子、下游具有LUC標簽的載體上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，與ApMYB306共同侵染煙草葉片，暗培養(yǎng)1 d，光照培養(yǎng)2 d后噴施LUC底物，用CCD冷凍相機觀察。結(jié)果表明，陰性對照（只加AtFTpro）亮度較強，添加ApMYB306后，亮度變?nèi)酰f明ApMYB306與AtFT啟動子結(jié)合，并抑制了其表達（圖9）。推測ApMYB306可能通過抑制AtFT啟動子表達使得ApMYB306超表達擬南芥株系開花延遲，其調(diào)控機制還需進一步研究。

3討論

隨著全球環(huán)境的不斷惡劣，干旱、洪澇等極端天氣頻現(xiàn)。植物的生長受逆境脅迫影響越來越嚴重。因此尋找抗逆脅迫下的應(yīng)答基因，解析其分子調(diào)控機制，是進行植物抗逆分子改良與育種的前提。本研究從雞爪槭金陵黃楓中克隆獲得了一個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子含有2個MYB保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)過蛋白質(zhì)氨基酸序列比對和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。

研究結(jié)果表明，不同的MYB家族成員具有不同的組織表達特性，可能在不同的組織器官中發(fā)揮重要作用。如柳枝稷PvMYB4在根、莖、葉、葉鞘和花序中均有表達，但在葉和葉鞘中表達量最高[24]。大部分的番茄R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在根、莖、葉和果實中均有表達，但表達水平不同，如SlMYB16在莖、葉和未成熟的果實中表達量都很高，但在根中表達量相對較低，SlMYB2、SlMYB20、SlMYB29、SlMYB43、SlMYB45、SlMYB53、SlMYB58、SlMYB73、SlMYB74、SlMYB79、SlMYB92、SlMYB93和SlMYB102在根中的表達量則高于其他組織器官[6]。ApMYB306在根、莖和葉中均有表達，但在莖和葉中的表達量遠高于根中的表達量。轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到靶基因的啟動子部位，進而激活或抑制靶基因的表達，該過程發(fā)生于細胞核中，因此轉(zhuǎn)錄因子必須要進入細胞核中，才能發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本功能。我們通過瞬時表達洋蔥表皮細胞，發(fā)現(xiàn)ApMYB306蛋白定位于細胞核中，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的基本條件。越來越多的證據(jù)表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在參與植物脅迫應(yīng)答調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[18，25-26]。水稻OsMYB55通過直接激活谷氨酸代謝途徑基因GS1、GAT1和GAD1提高對高溫脅迫的抗性，超表達OsMYB55可提高在高溫脅迫下的產(chǎn)量[25]。擬南芥AtMYB44負調(diào)控SOS2的基因ABI1、ABI2、PP2CA、HAB1和HAB2，使得超表達擬南芥對干旱和鹽脅迫的抗性增強[18]。小麥TaMYB33響應(yīng)ABA調(diào)控的脅迫應(yīng)答，超表達擬南芥株系耐旱性和耐鹽性增強，這些是通過TaMYB33提高細胞活性氧的清除能力和積累滲透壓調(diào)節(jié)物實現(xiàn)的[26]。桃PpMYB3的表達量變化則與溫度的變化趨勢一致，推測PpMYB3可能負調(diào)控桃的抗寒性[27]。小麥TaMYB165在小麥苗期和灌漿期均響應(yīng)熱脅迫，熱脅迫處理后，過表達擬南芥株系較野生型成活率升高[28]。燕子花IlMYB306也參與了非生物脅迫的調(diào)控[29]。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)分析了ApMYB306在不同脅迫下的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ApMYB306受高溫、低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達，在該4種脅迫誘導(dǎo)下表達量明顯上調(diào)，暗示ApMYB306參與了脅迫響應(yīng)過程，但其響應(yīng)機制還需進一步研究。

開花是高等植物生活史的重要過程[30-32]，目前已知的調(diào)控植物開花的主要途徑有：光周期途徑（Photoperiod pathway）、春化途徑（Vernalization pathway）[33]、赤霉素途徑（Gibberellin pathway）和自主途徑（Autonomous pathway）[34]。研究結(jié)果表明，多個MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了開花時間的調(diào)節(jié)。菊花CmMYB2超表達株系開花提前，CmMYB2通過赤霉素途徑調(diào)控菊花開花[20]。楊樹PtrMYB192基因超表達擬南芥株系較野生型開花延遲，其中春化途徑關(guān)鍵基因FLC表達量升高，而光周期途徑關(guān)鍵基因CO表達量降低[35]。擬南芥MYB30通過直接調(diào)節(jié)FT基因的表達調(diào)控開花[36]。本研究ApMYB306超表達擬南芥株系較野生型開花延遲，進一步研究發(fā)現(xiàn)ApMYB306可結(jié)合擬南芥FT的啟動子序列，并抑制其表達，F(xiàn)T基因是開花途徑的整合子，推測ApMYB306通過抑制FT的表達調(diào)節(jié)擬南芥開花。相關(guān)研究結(jié)果為ApMYB306進一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)，為培育雞爪槭抗逆和不同花期新種質(zhì)提供了候選基因。

參考文獻：

[1]LI S S， LI Q Z， TANG L， et al. Pigment comparison and expression of chlorophyll metabolism genes in yellow and green Acer palmatum leaves[J]. Canadian Journal of Plant Science， 2017， 97： 1-21.

[2]DUBOS C， STRACKE R， GROTEWOLD E， et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15：573-581.

[3]STRACKE R， WERBER M， WEISSHAAR B， The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2001， 4：447-456.

[4]YILMAZ A， NISHIYAMA M Y J， FUENTES B G， et al. GRASSIUS： a platform for comparative regulatory genomics across the grasses[J]. Plant Physiology， 2009， 149：171-180.

[5]CAO Z H， ZHANG S Z， WANG R K， et al. Genome wide analysis of the apple MYB transcription factor family allows the identification of MdoMYB121 gene confering abiotic stress tolerance in plants[J]. PLoS One， 2013， 8： e69955.

[6]ZHAO P P， LI Q， LI J， et al. Genome-wide identification and characterization of R2R3MYB family in Solanum lycopersicum[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2014， 289：1183-1207.

[7]WILKINS O， NAHAL H， FOONG J， et al. Expansion and diversification of the Populus R2R3-MYB family of transcription factors[J]. Plant Physiology， 2009， 149：981-993.

[8]AN J P， LI R， QU F J， et al. R2R3-MYB transcription factor MdMYB23 is involved in the cold tolerance and proanthocyanidin accumulation in apple[J]. The Plant Journal， 2018， 96（3）：562-577.

[9]AN Y， DAI X， ZHANG W H. A R2R3-type MYB gene， OsMYB2， is involved in salt， cold， and dehydration tolerance in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（7）：2541-2556.

[10]COMINELLI E， GALBIATI M， VAVASSEUR A， et al. A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance[J]. Current Biology， 2005， 15：1196-1200.

[11]OH J E， KWON Y， KIM J H， et al. A dual role for MYB60 in stomatal regulation and root growth of Arabidopsis thaliana under drought stress[J]. Plant Molecular Biology， 2011， 77：91-103.

[12]SEO P J， PARK C M. MYB96-mediated abscisic acid signals induce pathogen resistance response by promoting salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. New Phytologist， 2010， 186：471-483.

[13]AGARWAL M， HAO Y， KAPOOR A， et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281：37636-37645.

[14]COMINELLI E， SALA T， CALVI D， et al. Over-expression of the Arabidopsis AtMYB41 gene alters cell expansion and leaf surface permeability[J]. The Plant Journal， 2008， 53：53-64.

[15]LIPPOLD F， SANCHEZ D H， MUSIALAK M， et al. AtMyb41 regulates transcriptional and metabolic responses to osmotic stress in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2009， 149：1761-1772.

[16]REYES J L， CHUA N H. ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination[J]. The Plant Journal， 2007， 49：592-606.

[17]ABE H，URA T， ITO T， et al. Arabidopsis AtMYC2 （bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell， 2003， 15： 63-78.

[18]JUNG C， SEO J S， HAN S W， et al. Overexpression of AtMYB44 enhances stomatal closure to confer abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2008， 146：623-635.

[19]SHAN H， CHEN S M， JIANG J F， et al. Heterologous expression of the chrysanthemum R2R3-MYB transcription factor CmMYB2 enhances drought and salinity tolerance， increases hypersensitivity to ABA and delays flowering in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular Biotechnology， 2012， 51：160-173.

[20]ZHU L， GUAN Y X， LIU Y N， et al. Regulation of flowering time in chrysanthemum by the R2R3 MYB transcription factor CmMYB2 is associated with changes in gibberellin metabolism[J]. Horticulture Research， 2020， 7：96.

[21]CURTIS M D， GROSSNIKLAUS UA. Gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta[J]. Plant Physiol， 2003， 133：462-469.

[22]LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics， 2007， 23：2947-2948.

[23]ZHU L， MA Q Y， LI S S， et al. Reference gene selection for quantitative real-time PCR analyses of acer palmatum under abiotic stress[J]. Phyton-International Journal of Experimental Botany， 2020， 89：385-403.

[24]SHEN H ， HE X ， POOVAIAH C R， et al. Functional characterization of the switchgrass （Panicum virgatum） R2R3-MYB transcription factor PvMYB4 for improvement of lignocellulosic feedstocks[J]. New Phytologist， 2011， 193（1）：121-136.