碳納米管固定化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)

李麗娟 馬貴平 夏文靜

摘要：纖維素酶在環(huán)保型燃料乙醇的生產(chǎn)、中藥成分提取、食品、飼料、釀酒、石油開采、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)都具有一定的應(yīng)用前景，但由于纖維素酶的生產(chǎn)成本較高、生物活力較低，使得纖維素酶的應(yīng)用受到了局限。然而，固定化酶技術(shù)可以使酶重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，克服這一技術(shù)瓶頸。研究了多壁碳納米管固定化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)和重復(fù)使用性，并與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)做比較。結(jié)果表明，固定化纖維素酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為3.0，60 ℃放置120 min仍保持70%以上的原酶活力;通過動(dòng)力學(xué)模型研究發(fā)現(xiàn)，固定化酶的米氏常數(shù)（Km）值為0.588 mmol/L，較游離酶稍有增加;固定化酶于4 ℃下放置1個(gè)月，酶活力仍保持原酶活力的68%以上;固定化酶用于連續(xù)水解羧甲基纖維素，經(jīng)過6輪重復(fù)使用，固定化酶活力仍保持50%以上。與游離酶相比，固定化纖維素酶具有更寬的溫度范圍，更好的熱穩(wěn)定性及耐酸堿性，良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性及重復(fù)利用性。

關(guān)鍵詞：碳納米管;固定化;纖維素酶;固定化酶;酶學(xué)性質(zhì);酶活力

中圖分類號(hào)： S188+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0275-04

碳納米管自1991年被發(fā)現(xiàn)以來，由于性質(zhì)獨(dú)特[1]吸引人們的關(guān)注。碳納米管是由石墨片卷曲而成的圓柱狀結(jié)構(gòu)，報(bào)道較多的有單壁碳納米管和多壁碳納米管[2]，單壁碳納米管僅由1層石墨片圍繞中心軸卷曲而成，而多壁碳納米管由許多石墨片圍繞中心軸卷取形成[3]。相比于單壁碳納米管，多壁碳納米管具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性，且價(jià)格低廉、容易獲得、毒性較低、研究應(yīng)用較多[4-5]。

碳納米管固定化酶具有比表面積大、載酶量高、分散性好等特點(diǎn)[6-7]，并且碳納米管與酶長(zhǎng)度相似尺寸，有利于二者相互反應(yīng)[8]。此外，對(duì)碳納米管進(jìn)行功能化，有利于改變碳納米管的疏水結(jié)構(gòu)，便于酶的結(jié)合，因此表面功能化后的碳納米管，可為酶提供更加合適的微環(huán)境[4]。目前，研究者主要通過共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)交聯(lián)2種方式固定化酶，共價(jià)交聯(lián)方式固定化酶與載體通過共價(jià)鍵進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合較為牢固，但酶的結(jié)構(gòu)容易受到破壞[9];非共價(jià)交聯(lián)方式主要通過π-π堆積作用力、疏水作用力、靜電作用力等方式與酶結(jié)合，結(jié)合力較弱，但對(duì)酶的結(jié)構(gòu)影響較小[10]。碳納米管固定化酶，易于從反應(yīng)體系中分離，可重復(fù)使用，便于運(yùn)送和儲(chǔ)存，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低，有利于工業(yè)化應(yīng)用[11-13]。

微生物產(chǎn)纖維素酶活力較低，而且纖維素酶的生產(chǎn)技術(shù)較低，是限制纖維素酶在工業(yè)上大量使用的瓶頸之一[14]。本試驗(yàn)通過多壁碳納米管非共價(jià)交聯(lián)方式固定化纖維素酶，研究了多壁碳納米管固定化纖維素酶的最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)模型、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、重復(fù)使用性等酶學(xué)性質(zhì)，為纖維素酶廣泛應(yīng)用提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用綠色木霉纖維素酶，購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司，10 U/mg。所用多壁碳納米管購(gòu)自深圳納米港有限公司，外徑15～30 nm，長(zhǎng)1.5 μm。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

于2017年12月至2019年6月在烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 多壁碳納米管的功能化

將0.1 g的碳納米管和100 mL硝酸和硫酸的混酸溶液（體積比為1 ∶ 3），放入容積為200 mL的三角瓶中，之后將其放入超聲波清洗器中于40 ℃、40 kHz超聲4 h，待充分冷卻使碳納米管沉淀后，去上清，用蒸餾水對(duì)沉淀進(jìn)行分散。通過4 000 r/min離心去上清，反復(fù)操作6～7次，直至pH值接近中性為止，于80 ℃真空干燥48 h，冷卻干燥24 h，獲得功能化的多壁碳納米管[15]。

1.4 多壁碳納米管固定化纖維素酶

將20 mg的纖維素酶加入到5 mL pH值為5.0的50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，再加入 4 mg 的碳納米管，將上述溶液在水浴箱中40 ℃、200 r/min孵化3 h，3 800 r/min離心12 min后，小心移去上清液，重新分散到檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中清洗復(fù)合物，重復(fù)上述步驟至少4次，移去未結(jié)合的酶，將復(fù)合物在空氣中干燥24 h獲得多壁碳納米管纖維素酶固定化酶[16]。

1.5 纖維素酶活的測(cè)定

以羧甲基纖維素（CMC）為底物，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定[17]。吸取pH值為4.8的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液1.0 mL和1% CMC 0.5 mL，加入到25 mL試管中，并加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，在50 ℃水浴箱中反應(yīng)30 min，然后加入3 mL的DNS煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水定容至25 mL，混勻后在540 nm下比色測(cè)定。空白對(duì)照以0.5 mL蒸餾水代替酶液。 固定化纖維素酶活力的測(cè)定，是將游離酶活力測(cè)定中的 0.5 mL 適當(dāng)稀釋的酶液用0.5 mL蒸餾水和一定質(zhì)量的固定化酶來代替，其余步驟與游離酶酶活力的測(cè)定相同。

1.6 溫度對(duì)纖維素酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別置于30、40、50 、60、70 ℃的水浴箱中，15 min后取出，待冷卻到室溫進(jìn)行酶活力測(cè)定，以溫度為橫坐標(biāo)、相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

1.7 纖維素酶的熱穩(wěn)定性研究

將固定化酶和游離酶分別置于60 ℃的恒溫水浴箱中，每隔5 min取樣，待其冷卻至室溫測(cè)定酶活力。初始酶活力為100%，計(jì)算酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化的趨勢(shì)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

1.8 pH值對(duì)纖維素酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別加入pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，于40 ℃水浴15 min后取出，以pH值為橫坐標(biāo)、相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

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