烏鱉黑色素提取工藝及其結構性狀

陳逍遙 趙瓊瑜 彭振輝 宋偉

摘要：以烏鱉肌肉為原料，采用“脫脂—酶解—酸解”三步法提取烏鱉黑色素，研究脫除蛋白、分離純化烏鱉黑色素的工藝條件，通過掃描電鏡對烏鱉黑色素純化效果進行觀察，并用傅里葉紅外光譜儀對其結構進行分析。最佳脫脂工藝為：乙醇回流脫脂8次，料液比1 g ∶ 60 mL，脫脂率為98.99%。脫脂后用木瓜蛋白酶進行酶解，其最佳工藝為：酶底比為1 mg ∶ 2 g、酶解溫度60 ℃、酶解時間5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0，蛋白質脫除率最高;酸純化的最優工藝為：鹽酸濃度6 mol/L、料液比1 g ∶ 15 mL、時間4 h、溫度100 ℃，蛋白質脫除率最高。在“脫脂—酶解—酸解”條件下總雜質脫除率高達98.91%。通過掃描電鏡可見純化黑色素為均勻的橢圓形顆粒，顆粒表面光滑清晰，同時結合傅里葉紅外光譜具有非常典型的吲哚結構，提取的烏鱉黑色素純度高、結構完整，可用于降解和結構研究。

關鍵詞：烏鱉;黑色素;提取工藝;脫脂工藝;酶解工藝;酸純化工藝;結構性狀

中圖分類號： TS254.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0182-07

清溪烏鱉（Pelodiscus sinensis，簡稱烏鱉）是從中華鱉的體色變異個體經過擴繁得到的新品種[1]，是浙江省特有地方品種，其典型形態特征是全身體色烏黑，富含黑色素，具有很高的食用價值和藥用價值[2]。黑色素是目前所知唯一能保護生物體免受輻射傷害的天然內源性生物聚合體[3]，具有很強的生理活性，能夠有效地消除自由基[4-5]，對人體具有提高機體免疫力[6]、防止衰老[7-8]、抑制病毒[9]等功能，因此黑色素被廣泛應用于醫藥、食品和保健品等領域。

目前，天然黑色素的開發研究主要集中在植物和真菌類材料，包括黑米[10]、山杏[11]、黑木耳[12]、靈芝等[13]，主要采用超聲波輔助提取法。動物中黑色素與蛋白質緊密相連、不易分離，要獲得比較純凈的黑色素，就必須盡可能去除蛋白質等雜質。因此，動物來源的黑色素研究只局限在烏骨雞等少數動物材料中。但國內外學者主要從形態特征[1]、養殖性能[14]、營養成分[15]、同工酶[16]、細胞水平和DNA 分子水平[17]等方面對烏鱉種質資源進行研究。有關烏鱉中黑色素的研究卻鮮見報道。因此，本試驗以烏鱉為研究對象，系統建立烏鱉的黑色素提取工藝，探究烏鱉的黑色素結構性狀，有利于烏鱉的高附加值綜合利用，對加快黑色食品的發展具有十分重要的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成體烏鱉，體質量約為500 g，購于浙江清溪鱉業股份有限公司。

主要儀器有ME204型電子天平，購自梅特勒-托利多公司;DS-1高速組織搗碎機，購自上海標本模型廠;Alphal-4LSCplus冷凍干燥機，購自德國Christ公司;5810大容量低溫高速臺式離心機，購自德國Eppendorf公司;DHG9246A型電熱鼓風干燥箱，購自上海精宏實驗設備有限公司;Cary100紫外可見分光光度計，購自安捷倫科技有限公司;S-4800型場發射掃描電鏡，購自日本日立公司。

主要試劑有黑色素標準品（M2649），購自Sigma公司;木瓜蛋白酶，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;無水乙醚、石油醚、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等，均為國藥分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 烏鱉肌肉主要成分的測定 烏鱉肌肉中水分含量測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中105 ℃干燥恒重法;粗蛋白含量測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》自動凱氏定氮儀法;粗脂肪含量測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》索氏抽提法;灰分含量測定參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中550 ℃馬弗爐干法灰化法。

1.2.2 烏鱉肌肉預處理 在實驗室活體宰殺后剝離肌肉，在高速組織勻漿機中打碎成肉糜，于冷凍干燥機中凍干，-20 ℃密封保存備用。

1.2.3 脫脂工藝的優化 （1）單因素試驗。精確稱取樣品置于索氏提取器中，在不同溶劑（無水乙醚、石油醚、無水乙醇）、回流次數（4、5、6、7、8、9）、料液比（1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL、1 g ∶ 75 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 150 mL）等因素下測定脫脂效果。脫脂反應結束后，濾液真空濃縮，得烏鱉油脂，濾渣置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質量，稱質量，計算脫脂率，評價各條件對烏鱉肌肉脫脂效果的影響。

烏鱉油脂脫除率=烏鱉油脂質量（g）烏鱉粗脂肪含量（g）×100%。

（2）正交試驗設計。通過單因素試驗的優化，以無水乙醇為脫脂浸提試劑，選擇料液比（A）、回流次數（B）作為試驗因子，采用Design-Expert軟件設計L9（32）正交試驗條件，以脫脂率作為評價指標，篩選最佳脫脂工藝。

1.2.4 ?酶解制備黑色素的工藝優化 （1）單因素試驗。精確稱取一定量的脫脂樣品，將其置于蛋白酶反應液中，在不同蛋白酶[木瓜蛋白酶（55 ℃，pH值5.5）、胃蛋白酶（37 ℃，pH值2.5）、胰蛋白酶（37 ℃，pH值8.0）]、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、溫度（50、55、60、65、70、75 ℃）、酶底比[1 mg ∶ 4 g、1.5 mg ∶ 4 g、2 mg ∶ 4 g、3 mg ∶ 4 g、4 mg ∶ 4 g（質量比，下同）]、酶解時間（3、4、5、6、7 h）單因素下測定蛋白脫除效果。將樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質量，稱質量，計算蛋白質脫除率，評價各條件對烏鱉肌肉脫蛋白效果的影響。

蛋白質脫除率=烏鱉干肉（g）-酶解殘渣質量（g）烏鱉干肉質量（g）×100%。

（2）正交試驗設計。以單因素試驗篩選的酶解溫度（C）、酶解時間（D）、料液比（E）和酶解pH值（F）作為試驗因子，采用L9（34）正交試驗條件，以蛋白質脫除率為評價指標，篩選最佳工藝。

1.2.5 酸法純化黑色素的工藝優化 （1）單因素試驗。精確稱取一定量的黑色素粗品，將其置于鹽酸反應液中，在不同時間（1、6、12、24、48 h）、溫度（25、60、70、80、90、100 ℃）、鹽酸濃度（1、3、6、9、12 mol/L）、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 200 mL）單因素下測定黑色素純化效果。酸純化反應結束后，將樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質量，稱質量，計算雜質脫除率，評價各條件對烏鱉肌肉黑色素純化效果的影響。

雜質脫除率=酶解殘渣質量（g）-酸化殘渣質量（g）酶解殘渣質量（g）×100%。

（2）正交試驗設計。選擇鹽酸濃度（G）、時間（H）、溫度（I）和溫度（J）作為試驗因子，采用 L9（34） 正交試驗條件，以雜質脫除率為評價指標，對結果進行方差分析和顯著性分析，篩選最佳脫除工藝。

1.2.6 烏鱉黑色素的結構性狀 （1）電鏡掃描。將樣品均勻散布在導電膠上，置于金屬載物臺，用常規真空噴鍍法噴金90 s，放置于掃描電鏡下觀察，選取有代表性的視野進行顯微拍攝。（2）傅里葉紅外掃描。稱取1 mg烏鱉黑色素樣品、1 mg烏骨雞黑色素樣品和1 mg黑色素標準品，將樣品分別與0.1 g溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研成細粉，混合均勻，用紅外壓片機壓片。測定樣品在400～4 000 cm-1 范圍內的紅外吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 烏鱉肌肉基本成分分析

烏鱉肌肉中測定的水分含量為77.76%，干物質含量為22.24%。烏鱉肌肉干物質的營養成分如表1所示，粗蛋白的含量高達77.56%，脂肪比例為16.85%，灰分比例為5.59%。可見，烏鱉肌肉中主要成分為蛋白質，其含有的脂肪含量也較高。因此，要對烏鱉肌肉組織進行有效的脫脂和脫蛋白工藝。

2.2 脫脂工藝優化結果

2.2.1 烏鱉肉脫脂工藝優化的單因素試驗 在料液比為1 g ∶ 75 mL、回流溫度為90 ℃、回流8次的初始條件下進行脫脂單因素試驗，研究溶劑種類、料液比、回流次數對烏鱉肉脫脂率的影響，結果如圖 1 所示，烏鱉肌肉在無水乙醇中回流8次、料液比為1 g ∶ 60 mL時的脫脂率最高。

2.2.2 烏鱉肉脫脂工藝優化的正交試驗 烏鱉肌肉乙醇脫脂的正交試驗結果及方差分析如表2、表3所示。根據極差R值大小，2個因素的主次順序為B（回流次數）>A（料液比）。結合k值可知烏鱉肌肉脫脂率最高（98.99%）的條件是：料液比 1 g ∶ 60 mL、回流次數 8次。在9個試驗中8號試驗組為這一組合，因此A3B2組合為最優組合。根據方差分析結果可知，各因素在正交試驗所選水平下對烏鱉肌肉脫脂率都有影響，但回流次數和料液比對其影響不顯著（P>0.05） 。

2.3 酶法制備黑色素工藝優化結果

2.3.1 烏鱉肉蛋白質脫除工藝優化單因素試驗 在酶底比1 mg ∶ 4 g、料液比1 g ∶ 10 mL、酶解時間 4 h 的初始條件下進行黑色素酶解單因素試驗。蛋白酶種類、料液比、酶解pH值、酶解溫度、酶底比、酶解時間因素對烏鱉肌肉蛋白脫除效果的影響如圖2所示，木瓜蛋白酶在料液比為1 g ∶ 25 mL、pH值為5.5、溫度為60 ℃、酶底比為2 mg ∶ 4 g、酶解時間為6 h條件下可較大限度去除蛋白質。

2.3.2 蛋白質脫除工藝優化正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇木瓜蛋白酶和酶底比為2 mg ∶ 4 g為固定條件，以酶解溫度（C）、酶解時間（D）、料液比（E）、酶解pH值（F）為試驗因子設計L9（34）正交試驗，所得結果見表4。9組試驗結果中6號試驗蛋白質脫除率最高，高達95.90%，相應的水平組合為C2D3E2F1。根據數據的極差R值分析結果，主次因素依次為E（料液比）>C（酶解溫度）>F（酶解pH）>D（酶解時間）。結合k值進行分析可知，C2D1E2F1的組合較優異，該組合條件為：酶解溫度60 ℃、酶解時間5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0。在此條件下，蛋白脫除率為95.98%。因此C2D1E2F1為最優組合。方差分析結果（表5）表明，各因素在正交試驗所選水平下對烏鱉肉的蛋白脫除率都有影響，酶解溫度、酶解時間、料液比和pH值對其影響顯著（P<0.05）。

2.4 ?酸法純化工藝優化結果

2.4.1 雜質脫除工藝優化單因素試驗 酸化時間（G）、 酸化溫度（H）、 鹽酸濃度（I）和料液比（J）對烏鱉黑色素粗品雜質脫除率的影響如圖3所示，9 mol/L HCl溶液、溫度100 ℃、料液比1 g ∶ 20 mL條件下磁力攪拌24 h，烏鱉黑色素的雜質脫除率最大。但鹽酸濃度為9 mol/L及以上時，易爆塞、溶液濺出，危險性大，因此選擇6 mol/L。

2.4.2 雜質脫除工藝優化正交試驗 雜質脫除工藝優化的正交試驗結果如表6所示，方差分析見表7，9組中以2號蛋白質脫除率最高（71.52%），相應的組合為G2H1I2J3，即鹽酸濃度為6 mol/L、料液比為1 g ∶ 15 mL、 時間為4 h、溫度為100 ℃。通過對數據極差R值分析可知，影響脫除率的的主次因素依次為H（料液比）>J（酸化溫度）>I（酸化時間）>G（HCl濃度）。結合k值分析結果可知，G3H1I2J3的組合更佳，經驗證，該組合的蛋白質脫除率為71.84%，與G2H1I2J3的脫除率差異較小，同時考慮到鹽酸濃度越高，其腐蝕性越強，操作時對人體的危險系數大，因此最佳組合選擇G2H1I2J3。根據方差分析結果（表7）可知，在正交試驗所選水平下，各因素對黑色素粗品雜質脫除率都有顯著影響 （P<0.05）。

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