鄭州鯉養殖場鯉急性爛鰓病的癥狀與病原鑒定

吳玲梅 溫智清 楊雪冰 董國棟 李旭東 王飛 鄭曉聰 劉葒 賈鵬 毛明光

摘要：2019年6月，河南鄭州某鯉養殖場發生鯉急性爛鰓病，累計死亡率約40%。為研究發病病因和疾病流行規律，對病魚解剖，進行細菌和寄生蟲檢測、組織病理學檢測、PCR檢測和系統進化分析。結果顯示，病魚體表黏液增多，眼球凹陷，頭蓋骨凹凸不平，鰓腫脹并伴有潰爛，腎臟腫大至鰾間隔。體視鏡下可見病魚鰓絲末端鈍圓、呈棒狀，鰓絲間充滿大量黏液。組織病理學檢查可見病魚鰓絲和鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合。PCR方法從病魚中檢出鯉浮腫病毒（carp edema virus，CEV），而SVCV和KHV檢測結果為陰性。另外，病魚體表和鰓并未見任何寄生蟲，細菌學檢測也未分離到任何與鯉爛鰓病相關的病原菌。遺傳進化分析表明，此次檢出的CEV毒株屬于Ⅱa基因亞型，且與中國分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）的同源性最高，約為98.8%。初步推斷Ⅱa基因亞型CEV可能是引起此次鄭州鯉急性爛鰓病的主要病因，后續養殖中需加強對該病進行防控。

關鍵詞：鯉急性爛鰓病;鯉浮腫病毒;癥狀;病原鑒定

中圖分類號：S941.42+4 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0167-06

2018年我國水產養殖業總產量達4 991.06萬t，約占世界水產養殖總產量的60%，是世界上唯一水產品養殖總量超過捕撈總量的漁業國家。鯉魚作為我國第四大淡水養殖品種，2018年總產量達到296.2萬t[1]，是我國消費者動物性蛋白的主要來源之一。河南省作為黃河鯉養殖大省，其2018年產量約23.0萬t，居全國第三。然而，老病新發、外來病和新發疫病等情況成為鯉養殖產業發展的瓶頸，例如鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp，SVC）和錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease，KHVD）等老病以及鯉急性爛鰓病等新發疫病[2]。鯉急性爛鰓病作為一種新發疫病，自2003年在河南地區出現以來，逐漸在河南鯉養殖體系廣泛流行，養殖池塘發病率約60%，單個池塘累計死亡率為50%～80%[3-4]，對當地鯉養殖業造成巨大經濟損失。2013年洛陽市因該病造成約1 000 t鯉死亡，損失上千萬元[3]。然而，對于這種新發疫病，無論鯉養殖從業者還是魚病研究人員均未能提出有效防控措施，究其原因是該病的病原尚不明確。2019年6月，鄭州某鯉養殖場暴發鯉急性爛鰓病，本研究采集樣品后對其進行初步分析，以探究其發病原因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月，河南省鄭州市某鯉養殖場暴發鯉急性爛鰓病，發病鯉體質量400～500 g，累計死亡率約40%，發病水溫23 ℃。隨機采集10尾瀕死鯉，低溫保存帶至實驗室作進一步分析。

1.2 細菌和寄生蟲檢測

肉眼檢查病魚體表、鰓、肝臟、腸道等組織是否有寄生蟲。同時對鰓絲制備組織壓片，在光學顯微鏡下進行寄生蟲觀察。

無菌條件下，用無菌環從病魚腎臟和肝臟挑取樣品，劃線接種于BHIA平板，28 ℃恒溫培養24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.3 鰓絲病理觀察

取部分病魚鰓置于含有生理鹽水的平皿中，輕輕漂洗1次，將其轉移至新的生理鹽水中，置于體視鏡（Leica，德國）下進行形態觀察。同時，采集健康鯉的鰓作為對照。

1.4 組織病理學檢測

采集病魚的鰓組織樣本，切成約5 mm×5 mm組織塊，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。固定組織經水洗、乙醇梯度脫水、甲苯透明、石蠟浸泡后包埋呈石蠟組織塊。在常溫下，采用Leica組織切片機進行連續切片（厚度5 μm），載玻片貼附37 ℃過夜后HE染色。切片經二甲苯脫蠟-乙醇梯度復水-水洗-蘇木素染色-分化藍化-伊紅復染-乙醇梯度脫水-二甲苯透明-樹脂膠包埋-膠包70 ℃烤片48 h。HE染色結果為細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，脂滴和水泡不著色。染色結果經光學顯微鏡（Zeiss，美國）觀察并拍照記錄。

1.5 PCR檢測

采集病魚的鰓、腦、腎臟和脾臟混合并勻漿，取約30 mg用于核酸抽提。使用TaKaRa MiniBEST viral RNA/DNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取總核酸（DNA和RNA），操作步驟詳見試劑盒說明書。總核酸用于檢測CEV、KHV和SVCV，PCR引物和擴增靶基因見表1。CEV套式PCR體系和反應條件參見溫智清等的研究方法[5]。KHV和SVCV檢測參考《水生動物疾病診斷手冊》“2.3.7”章[6]和“2.3.9”章[7]。PCR檢測樣品設置2個復孔，并設立陰性對照和陽性對照。

1.6 電泳和測序分析

使用QIAxcel 全自動凝膠電泳儀（QIAgen，德國）對PCR產物進行電泳分析。PCR擴增產物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。使用clustal W生物學軟件megalign方法對共計31條CEV序列進行比對，使用MEGA X生物學軟件maximum likelihood method中的Tamura 3-parameter模型進行遺傳進化分析，序列之間比對1 000次。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

發病魚主要的臨床癥狀為在水面聚集慢游，鰓腫脹并潰爛（圖1-A），唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平（圖1-B），眼睛凹陷（圖1-C），腎臟腫大至鰾間隔（圖1-D）。

2.2 細菌和寄生蟲檢測

將挑去的肝臟和腎臟組織樣品置于BHIA培養基上培養48 h，未見優勢菌落生長。病魚體表和鰓絲壓片觀察未見寄生蟲。

2.3 鰓絲病變

正常鯉鰓絲末端呈尖狀，形態清晰，且無白色黏液（圖2-A）。體視鏡下，可見病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態不清，鰓絲周圍附有白色絮狀黏液（圖2-B）。

2.4 組織病理變化

組織病理學結果表明，健康鯉鰓絲組織結構正常，鰓小片呼吸上皮細胞偶見空泡變性，鰓絲和鰓小片毛細血管豐富，偶見上皮細胞脫落（圖3-A）?；疾◆~鰓絲、鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生，相互融合（圖3-B）。

2.5 PCR檢測

PCR檢測結果表明，KHV和SVCV未見特異性擴增，檢測結果均為陰性;CEV套氏PCR第一步PCR和第二步PCR分別擴增出528 bp和478 bp大小的目的條帶，表明CEV PCR檢測結果呈陽性（圖4）。

2.7 CEV序列分析

對CEV第一步PCR產物進行測序，并以CEV P4a的357 bp基因片段進行遺傳進化分析。結果表明，此次河南鄭州檢測到的CEV 20190530株屬于Ⅱa基因亞型（圖5），并且和中國分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，約為98.8%。

3 討論

根據病原和導致臨床癥狀的不同，通常將鯉急性爛鰓病分為寄生蟲性爛鰓、細菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓3種[3]。寄生蟲性爛鰓常見于黏孢子蟲[9]、指環蟲、車輪蟲[10]和三代蟲[11]等引起的爛鰓病，肉眼可見病魚體表、內臟或鰓上的寄生

蟲，鰓上附有白點狀的黏孢子蟲包囊，顯微鏡下可見包囊中有大量孢子[12]。細菌性敗血癥性爛鰓主要是由柱狀屈橈桿菌[11]和柱狀黃桿菌[13]等引起，可分為慢性爛鰓和急性爛鰓，普通鯉、草魚和鰱等鯉科魚類均易發生。腎炎型急性爛鰓可能由KHV[14-15]等病毒性病原引起，常見于普通鯉和錦鯉感染后發病。河南地區流行的鯉急性爛鰓病也同樣分為寄生蟲性爛鰓、細菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓，這3種爛鰓病在河南地區發病占比分別為1%～2%、60%～70%和30%～40%[3]。多家科研單位從河南鯉急性爛鰓病病魚中鑒定出KHV、柱狀黃桿菌、維隆氣單胞菌、霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、腐敗瓦希菌群等[3]。因此，在發生鯉急性爛鰓病時，應該通過臨床癥狀和實驗室檢測結果加以區分，做到有針對性地治療。

CEV感染主要發生于15～25 ℃，表現為普通鯉體表浮腫或錦鯉嗜睡，鰓潰爛壞死，眼睛凹陷[16]。此次鄭州某鯉養殖場暴發鯉急性爛鰓病時水溫約為23 ℃，病魚出現以唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平、眼睛凹陷、腎臟腫大至鰾間隔的主要臨床癥狀，發病水溫和部分臨床癥狀與鯉浮腫病毒感染相似。體視鏡下可見病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態不清，鰓絲周圍附有白色黏液，患病魚鰓絲和鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合，這和CEV的組織病理特征相吻合。Way等報道，被CEV感染的病魚鰓上皮細胞腫大并大量增生，鰓小片相互融合[16-17]。PCR方法從鄭州發病鯉僅檢出CEV，且基因序列與CEV中國分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）同源性約為98.8%，而細菌和寄生蟲檢測均為陰性，且養殖戶表述在鯉急性爛鰓病發生期間，使用抗生素無效反而加重其死亡，排除了致病性細菌和寄生蟲感染的可能。另外，徐立蒲等從河南5個出現有爛鰓癥狀的鯉養殖場中檢出CEV，而KHV均為陰性[18]。因此，初步推斷此次河南鄭州某鯉養殖場發生的鯉急性爛鰓病為腎炎型急性爛鰓病，其病原為CEV。但該結論還有待于通過柯赫氏法則做進一步驗證，并且由于鯉感染KHV后，其臨床癥狀和CEV感染的臨床癥狀十分相似[5，17]，所以臨床上可對CEV和KHV同時進行檢測，以盡快確定病因。

自1970年代日本新潟首次報道CEV以來，該病毒可能已通過錦鯉國際貿易傳播至世界其他國家[16]。2015年，我國首次在杭州某錦鯉養殖場鑒定出CEV[19]，隨后在云南[5]等多地均有確診。此次從河南鄭州患腎炎型急性爛鰓病病魚中檢出CEV，分析其P4a基因片段（357 bp）發現，與中國分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，均為98.8%，屬于Ⅱa基因亞型，推測CEV有可能通過錦鯉貿易從日本傳入我國，進而從錦鯉養殖體系傳入普通鯉養殖體系。目前，基于CEV P4a基因的遺傳進化分析，可將CEV主要分為Ⅰ和Ⅱ基因型;其中，CEVⅡ基因型可分為Ⅱa和Ⅱb這2個基因亞型[8]，并且隨著研究的逐步深入，可能會發現更多新的CEV基因型[20]。但這些新的基因型也需要更多的研究結果證實其科學性。

目前，對因CEV感染引起的急性爛鰓病尚無有效的治療措施，濫用藥物、大換水、拉網捕撈等刺激性措施均會加重病魚死亡，所以應以預防為主。日常應提高養殖場管理水平，避免外來水生動物或其他污染物進入養殖場;定期對養殖場進行疫病監測;保持良好的養殖環境，及時清理死魚;對水源進行嚴格管理，養殖廢水要進行無害化處理;同時在引進苗種時，一定要做好隔離檢疫。

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