化瘀通絡灸對VD大鼠體外干預HUVEC-12細胞VEGF、bFGF蛋白表達的影響

張曼 陸定其 吳偉偉 楊駿

[摘要] 目的 觀察化瘀通絡灸對VD大鼠血清體外干預HUVEC-12細胞VEGF、bFGF蛋白表達的影響。 方法 采用四血管阻斷法制造VD大鼠模型，隨機分為艾灸組、模型組、西藥組，另設假模型組作為對照，艾灸組采用化瘀通絡灸法，取百會、神庭、大椎艾灸，西藥組茴拉西坦灌胃，每日一次，治療2個療程，采用跳臺實驗檢測各組神經行為學評分。取艾灸組、模型組、假模型組VD大鼠的血清體外培養HUVEC-12細胞，另設平行培養液組作為對照，采用Western blot法檢測各組VEGF、bFGF的蛋白表達。 結果 治療結束后，與模型組潛伏期為（36.25±10.71）s、錯誤次數為（6.19±0.74）次、神經行為學評分為（3.00±0.53）分比較，艾灸組和西藥組的潛伏期為（232.31±22.25）s和（201.38±13.12）s，均延長（P<0.01）;錯誤次數為（1.00±0.56）次和（2.53±0.84）次及神經行為學評分為（1.00±0.56）分和（1.74±0.47）分，均降低（P<0.01）。艾灸組和西藥組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組、假模型組、平行液組比較，艾灸組的HUVEC-12細胞VEGF、bFGF的蛋白表達水平（0.84±0.09）和（0.87±0.05）較高，有顯著差異（P<0.01）。 結論 化瘀通絡灸法能夠明顯提高VD大鼠學習記憶能力，增強HUVEC-12的VEGF、bFGF的蛋白表達，其治療VD可能與其促血管生成作用相關，為針灸治療VD提供理論依據。

[關鍵詞] 血管性癡呆;化瘀通絡灸;血管生成;VEGF;bFGF

[中圖分類號] R245? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）33-0033-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Huayu Tongluo Moxibustion on the expression of VEGF and bFGF protein in HUVEC-12 cells of VD rats in vitro. Methods The four-vessel blocking method was used to make VD rat models， and they were randomly divided into the moxibustion group， model group， and western medicine group. Another fake model group was set up as the control group. The moxibustion group was treated with moxibustion for removing blood stasis and dredging collateral， taking Baihui and Shenting， Dazhui for moxibustion. The western medicine group was given aniracetam lavage once a day for two courses of treatment. The platform jumping experiment was used to detect the neurobehavioral score of each group. HUVEC-12 cells were cultured in vitro from the serum of VD rats in the moxibustion group， the model group， and the sham model group， and the parallel solution group was also set up as the control group. Western blot was used to detect the protein expression of VEGF and bFGF in each group. Results After treatment， compared with the model group's incubation period was（36.25±10.71） seconds， the number of errors was（6.19±0.74）times， and neurobehavioral score was（3.00±0.53） points， the incubation period of the moxibustion group and the western medicine group was（232.31±22.25） seconds and（201.38±13.12） seconds were prolonged（P<0.01）; The number of errors was（1.00±0.56） times and（2.53±0.84） times and neurobehavioral scores was（1.00±0.56）points and（1.74±0.47）points were decreased（P<0.01）. The difference between the moxibustion and western medicine groups was statistically significant（P<0.05）. Compared with those of the model group， sham model group， and parallel solution group， the protein expression levels of VEGF and bFGF in HUVEC-12 cells in the moxibustion group（[0.84±0.09] and [0.87±0.05] ） were higher， with significant differences（P<0.01）. Conclusion Huayu Tongluo Moxibustion can significantly improve the learning and memory ability of VD rats， and enhance the protein expression of VEGF and bFGF of HUVEC-12. Its treatment of VD may be related to its pro-angiogenesis effect， which provides a theoretical basis for VD's acupuncture treatment.

[Key words] Vascular dementia; Huayu Tongluo Moxibustion; Angiogenesis; VEGF; bFGF

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）多由腦血管疾病引起認知功能障礙[1]。隨著我國人口老齡化的不斷增加，VD的發病率隨年齡逐漸增加，80～89歲為4.09%，90歲以上為6.10%[2]，是目前影響中老年人健康和生活質量的常見病、多發病。有學者研究發現其可能與大腦皮層、海馬的病變有關[3]。近年來針灸治療VD臨床及實驗研究均取得較好的進展[4-6]，尤其是“化瘀通絡灸法”的運用。在腦缺血后的血管新生過程中，血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）發揮重要作用[7]。人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）作為血管內皮細胞研究較為穩定，可作為干預的觀察對象。實驗先行HUVEC細胞株的復蘇和傳代，然后經艾灸治療的動物血清干預人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）培養。本研究觀察化瘀通絡灸對VD大鼠體外干預HUVEC-12細胞VEGF、bFGF蛋白表達的影響，探討其治療血管性癡呆可能的有效機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥物

清艾條（Φ10 mm×100 mm，由安徽省天長市壽民灸具廠提供），茴拉西坦膠囊（0.1 g×30片/瓶，無錫市凱西藥業有限公司，批號 20090112），TGL-20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），DTT-2 大鼠跳臺儀（由北京中國中醫科學研究院提供），電化學發光（ECL）試劑盒（美國pierce公司），PRMI-1640培養液（GIBCO公司），EDTA（Hyclone公司），一抗兔抗人VEGF、一抗兔抗人bFGF、二抗羊抗兔IgG抗體（合肥泓杉生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠60只，每只（250±50）g，由南京醫科大學實驗動物中心提供，SCXK（蘇）2008-0004。假模型組8只由電腦隨機數字法得出，其余大鼠復制血管性癡呆的模型，跳臺實驗篩選出合格癡呆大鼠24只，并隨機分為艾灸組、西藥組和模型組，每組8只。

1.3 造模[8]

四血管阻斷法復制VD大鼠模型。假模型組保留雙側頸總動脈不予阻斷。術后手術部位施以適量青霉素對抗感染，常規飼養。通過跳臺實驗篩選出符合條件的大鼠。將 2只大鼠放于2間內，適應3 min后通以40 V的交流電5 min。然后將其置于絕緣體平臺后開始計時，第一次跳到銅柵上的時間作為潛伏期，5 min內跳下銅柵再跳回到平臺的次數記錄為錯誤次數，兩者作為大鼠行為學記憶成績。假模型組和已造模組大鼠在模型復制后4 d進行初次神經行為學評分，艾灸組和西藥組于第二療程治療結束后6 h再次進行評分;模型組和假模型組平行進行神經行為學評分。按照改進的Longa[9]的5級評分標準，評分1～4分納入實驗。

1.4 方法

艾灸組采用化瘀通絡灸法治療，具體的操作方法是將大鼠固定于鼠板上，百會穴、神庭穴、大椎穴處剃毛參照實驗動物穴位圖點穴[10]。百會：頂骨正中;神庭：在額頂骨縫交界線前方;大椎：第7頸椎與第1胸椎之間。百會穴隔附子餅壓灸，用附子粉、黃酒制成直徑約15 mm、厚約5 mm附子餅，中間用針刺10個小孔。點燃清艾條在附子餅上壓灸，皮膚灼熱潮紅時立即提起，旋即再壓灸，共20 min，大椎穴和神庭穴懸起灸20 min。每天1次，15 d為1個療程 ，共治療2個療程。西藥組將茴拉西坦與蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液灌胃，每千克大鼠茴拉西坦0.0625 g，療程與艾灸組平行。模型組與假模型組鼠板固定后不做治療，時間上與艾灸組相平行。

1.5 血清制備

艾灸組大鼠在每個療程結束后，在目內眥取血2 mL，以3000 r/min離心15 min，然后同組的血清混合，56℃、30 min進行滅活，0.22 μm微孔濾膜進行過濾除菌，-20℃保存備用;模型組和假模型組制備血清的方法與艾灸組相同，西藥組不制備。

1.6 HUVEC-12培養、分組及血清干預

1.6.1 復蘇及傳代培養? 將HUVEC-12細胞株置于40℃溫水中搖晃，移至離心管，加入含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）及5%100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI-1640的培養基中，稀釋5倍，混勻，以1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養液反復吹打混勻，5%CO2、37℃飽和濕度培養箱培養，出現80%融合狀態時，以0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.6.2 種板? 棄去細胞培養液，加入胰酶2 mL消化30 s～1 min后，棄去胰酶，加入全細胞培養液3 mL，吹打細胞使之脫落為單個細胞，進行細胞計數。按每孔105個細胞的密度接種于12孔培養板，繼續培養細胞使其達到80%的密度。

1.6.3 分組及血清干預? 實驗HUVEC-12分為四組，艾灸組配制含10%艾灸組大鼠血清的RPMI-1640;模型組和假模型組分別配制含10%模型組與假模型組大鼠血清;平行培養液組配制含10%胎牛血清。取貼壁生長的單層細胞，換用無血清RPMI-1640培養液培養4 h。每組設6個復孔，更換不同的培養液，繼續培養24 h。

1.7 Western blot法檢測各組HUVEC-12細胞VEGF、bFGF蛋白的表達

PBS清洗細胞，加入RIPA細胞裂解液100 μL提取總蛋白，以BCA法檢測上清液中蛋白濃度，按1∶1加入1×上樣緩沖液。SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，加入Western封閉液，室溫封閉2 h。加入一抗（VEGF、bFGF、Beta-actin抗體）4℃孵育過夜，清洗后加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，將漂洗過的濾膜在雙蒸水中平衡5 min。取1 mL A、B液等比例混合底物，將發光劑和增強劑均勻的涂抹徹底覆蓋薄膜，避光處理5 min棄去表面液體。最后采用X膠片顯影。結果采用Quantity one 灰度分析軟件分析圖像。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，方差不齊采用t'檢驗，多組均數間比較采用方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗對數據進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模4 d VD大鼠神經行為學評分比較

見表1。造模組大鼠神經行為學評分均大于1，平均（2.45±0.76）分，表明造模成功。與假模型組比較，造模組大鼠的潛伏期、錯誤次數經t（t'）檢驗均有顯著性差異（P<0.01，P<0.01），造模組大鼠的潛伏期顯著短于假模型組，錯誤次數顯著多于假模型組，表明VD模型大鼠的學習記憶成績顯著低下。

2.2 治療后各組VD大鼠神經行為學評分比較

見表2。與模型組比較，艾灸組、西藥組潛伏期較長，錯誤次數及神經行為學評分較低，差異有統計學意義（P<0.01）;與西藥組比較，艾灸組潛伏期較長，錯誤次數及神經行為學評分較低，差異有統計學意義（P<0.05）。以上數據表明化瘀通絡艾灸組和西藥組均可以提高VD大鼠潛伏期，降低了VD大鼠錯誤次數及神經行為學評分，且艾灸組的療效更顯著。

2.3 Western blot法檢測艾灸效應血清干預HUVEC-12的VEGF、bFGF蛋白表達水平

HUVEC-12細胞形態見封三圖2。四組HUVEC-12細胞間VEGF、bFGF的蛋白表達的檢測結果均有差異（P<0.01或P<0.05），見表3、圖1。與模型組、假模型組、平行培養液組比較，艾灸組的HUVEC-12細胞VEGF、bFGF的蛋白表達具有顯著性差異（P<0.01）。與假模型組比較，模型組VEGF、bFGF的蛋白表達有差異（P<0.05）。結合神經行為學評分，說明兩個療程治療后，化瘀通絡灸法組大鼠艾灸效應血清對HUVEC-12細胞VEGF、bFGF的蛋白表達水平較高，具有臨床意義。

3 討論

《靈樞經·海論》有“腦為髓之海……髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，懈怠安臥”。田金州等[11]認為，腦髓受損失養，風、火、痰、瘀諸邪內阻，致腦脈閉阻即發為VD。崔遠武[12]認為在平臺期和波動期以肝腎陰虛為本，痰瘀為實，表現為本虛標實。由此可見，VD病位在腦，其病性不外乎虛、痰、瘀、火，相互影響相互轉化，其中瘀是關鍵病機。艾灸作為中醫眾多治療手段中獨具特色的一種治療方法，中醫針灸工作者在血管性癡呆的臨床治療中，發現艾灸對血管性癡呆的獨特療效[13-15]。百會穴位于督脈上，膀胱經通過此穴“入絡腦”;神庭穴為督脈與足太陽膀胱經的交會穴，其深部為大腦頂葉、額葉所在，針灸此穴可“氣至病所”從而改善額葉功能。大椎穴為“諸陽之會”，可通調頭部氣血。臨床借助艾火的“溫經通絡”作用，附子餅的“溫腎補陽，培補命門”作用，因此具“化瘀血，通腦絡，填髓醒神”之功，稱為“化瘀通絡灸”。有大量試驗研究發現[16-19]，化瘀通絡灸法治療能有效改善VD患者臨床癥狀、神經行為學評分，但化瘀通絡作用機制關鍵環節不詳，可能存在的促血管生成機制還不清楚，是否通過啟動了“血管生成”的扳機而引發腦內學習記憶要害部位的神經營養和神經元保護作用，其治療作用可能與通過調控血管活性物質，調節RAGE和LRP-1的表達，改善大腦皮層額葉和海馬CA1區神經元線粒體損傷等方面來實現的。實驗前期課題組查閱了有關血管內皮細胞培養的文獻資料，并調研了相關研究實驗技術人員和專家，發現當前使用的人臍靜脈內皮細胞株ECV304作為血管內皮細胞使用存在著一些不確定因素，如有報道該細胞株有分化為膀胱內皮的傾向，而人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）較為穩定，因此最終選取了HUVEC 作為干預的觀察對象。此次試驗進一步分析血清干預對HUVEC-12表達VEGF、bFGF蛋白影響，獲取化瘀通絡灸法治療VD的相關可能機制。

現代醫學認為，VD發病機制可能與膽堿能通路損傷、興奮性氨基酸受體發生激活并導致神經元細胞死亡、氧化應激損傷過程等有關[20]。有研究發現，血管生成和炎癥標志物如VEGF、bFGF、MMP1和IL-8與VD的發生關聯密切[21]。VEGF和bFGF能夠協同作用促進成熟血管形成和有絲分裂，兩者在缺血性腦損傷后水平急劇下降[22]，是參與VD病理過程的重要因子。VEGF是血管內皮細胞特異性促有絲分裂原，可影響內皮細胞和壁細胞調控血管生成和成熟。其中VEGF-A具有促進神經膠質細胞向神經元轉化，與神經再生關系密切[23];bFGF作為另一種重要的血管生長因子，可促進神經性血小板衍生生長因子受體β的表達，促進軸突分支形成并刺激神經前體的增殖和分化[24]。本研究以HUVEC-12作為靶細胞，對VD大鼠血清干預細胞的VEGF、bFGF蛋白表達進行比較，并對VD大鼠的學習記憶成績、神經行為學進行檢測及評定，發現化瘀通絡灸法組的效應血清能增強細胞株表達VEGF、bFGF血管活性蛋白，提高大鼠學習記憶成績，揭示化瘀通絡灸法治療VD的效果及可能的作用機制，為針灸治療該病的臨床有效性提供理論依據。

[參考文獻]

[1] 翁映虹，黃堅紅. 血管性癡呆的定義及診斷進展[J].廣東醫學，2010，31（14）：1881-1882.

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[3] Snowden J. Vascular cognitive impairment：Preventable dementia[J]. Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry，2005，75（6）：941.