Hedgehog通路在缺氧誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制研究

傅之梅 胡兵偉 王錢東 馬婷婷

[摘要] 目的 探討Hedgehog通路在缺氧誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制。 方法 選擇2018年1月～2019年8月浙江省立同德醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者5例，取其腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、抑制劑處理組、乏氧組和乏氧加抑制劑處理組。各組細(xì)胞均完成48 h培養(yǎng)，采用Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞Smoothened（SMO）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）E-cadherin基因表達(dá)，采用BrdU-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲作用。 結(jié)果 Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平低于乏氧組、抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05）;乏氧組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05）。BrdU-ELISA法結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05）。Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組細(xì)胞侵襲率低于乏氧組，但明顯高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05）;乏氧組細(xì)胞侵襲率高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 Hedgehog通路可能通過SMO、GLI1調(diào)控EMT，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，在缺氧誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，能為腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移治療提供新的靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] Hedgehog通路;Smoothened;神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;缺氧誘導(dǎo);腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移

[中圖分類號(hào)] R739.41? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）32-0020-04

[Abstract] Objective To explore the role and molecular mechanism of Hedgehog pathway in hypoxia-induced glioma metastasis. Methods From January 2018 to August 2019， a total of 5 patients with glioma from Tongde Hospital of Zhejiang Province were selected as subjects. Glioma cells were collected and randomly divided into a control group， an inhibitor-treated group， a hypoxia group， and a hypoxia combined with inhibitor-treated group. The cells in each group were given 48 hours of culture. The expression of Smoothened（SMO）， glioma-associated oncogene homologous protein 1（GLI1） and epithelial mesenchymal transformation（EMT） E-cadherin genes were detected by Westernblot， cell proliferation was detected by BrdU-ELISA method， and cell invasion was detected by Transwell method. Results Westernblot test results showed that the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia combined with inhibitor-treated group were lower than those in the hypoxia group， inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia group were higher than those in the inhibitor-treated group and the control group（P<0.05）; the results of BrdU-ELISA showed that the cell proliferation rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group at different time points was lower than that in the hypoxia group， but was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; Transwell test results showed that the cell invasion rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group was lower than that in the hypoxia group， but was significantly higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the cell invasion rate in the hypoxia group was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）. Conclusion Hedgehog pathway may participate in the occurrence and development of EMT through SMO and GLI1 regulations， which play important roles in hypoxia-induced glioma metastasis and can provide a new target for the treatment of glioma metastasis.

[Key words] Hedgehog pathway; Smoothened; Glioma-associated oncogene homologous protein 1; Epithelial mesenchymal transformation; Hypoxia-induced; Glioma metastasis

膠質(zhì)瘤是臨床常見的惡性腫瘤，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中較為常見，占顱腦腫瘤的35.26%～60.96%，其發(fā)病率占腦腫瘤首位，死亡率居第二位[1]。由于膠質(zhì)瘤具有高浸潤(rùn)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，導(dǎo)致手術(shù)無法保證腫瘤的完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率近90.0%，且隨著手術(shù)次數(shù)、復(fù)發(fā)次數(shù)的增加，惡性程度具有增加趨勢(shì)。缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，能促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用[2-3]。臨床研究顯示，介導(dǎo)缺氧應(yīng)答的主要轉(zhuǎn)錄因子-缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-α）在腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中過表達(dá)，且與腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)[4-5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是將具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活性能力、能在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過程[6]。Suh[7]的研究表明，Hedgehog通路中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子GLI1及上游轉(zhuǎn)膜蛋白SMO亦是上述缺氧/JDAC3調(diào)節(jié)的靶基因，哺乳動(dòng)物Hedgehog通路由三種HH配體激發(fā)，能與受體轉(zhuǎn)膜蛋白Patched1（PTCH1）結(jié)合，從而阻斷PTCH1對(duì)轉(zhuǎn)膜蛋白SMO的抑制功能，釋放SMO活性，實(shí)現(xiàn)下游靶基因的調(diào)控作用[8-9]。因此，本研究以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Hedgehog通路在缺氧誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月～2019年8月浙江省立同德醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者5例。取其腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，隨機(jī)均分為對(duì)照組、抑制劑處理組、乏氧組和乏氧加抑制劑處理組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 材料與設(shè)備? 胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、Transwell小室（美國(guó)Becton Dickinson）、人工基質(zhì)膠Mateigel（美國(guó)Becton Dickinson）、青/鏈霉素，RIPA裂解液、BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司）。

1.2.2 細(xì)胞處理[10-11]? 取腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，將細(xì)胞接種在濃度為10.0%的胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基中，放置在37℃、濃度為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80.0%以上時(shí)，開始傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)前去除原培養(yǎng)液，并利用PBS緩沖液連續(xù)進(jìn)行2次漂洗。向獲得的溶液中加入濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞回縮、變圓后，將消化液吸出，并加入完全培養(yǎng)液終止消化。利用吸管反復(fù)、輕柔吹打培養(yǎng)瓶底，使細(xì)胞充分脫離瓶壁。取細(xì)胞懸液15 mL放置在離心管中，連續(xù)進(jìn)行8 min離心，離心速度1000 rpm，去除上清液;向獲得的細(xì)胞懸液中加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3天換液一次，待細(xì)胞融合90.0%時(shí)再次傳代，取第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，將其隨機(jī)分裝在不同的試管中進(jìn)行分組。對(duì)照組不采取任何措施處理及干預(yù)，向細(xì)胞中加入培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)完成48 h培養(yǎng);抑制劑處理組在常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入SANT1、GANT61處理48 h;乏氧組在收細(xì)胞前24 h由常規(guī)培養(yǎng)改為低氧（1%O2）培養(yǎng)，連續(xù)完成48 h培養(yǎng);乏氧加抑制劑處理組在低氧培養(yǎng)24 h后加抑制劑處理48 h。各組細(xì)胞處理后放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱為37℃、5%CO2、飽和濕度[12]。

1.2.3 檢測(cè)方法? （1）典型基因標(biāo)志表達(dá)：采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Smoothened（SMO）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)[13]。具體步驟包括：①蛋白質(zhì)的提取;②蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳;③蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印;④封閉;⑤一抗、二抗孵育;⑥顯影。將最終處理后的PVDF膜，以β-actin作為內(nèi)參物，根據(jù)正確的位置、方法放置在發(fā)光板（蛋白面板）上，并加入少許發(fā)光液，選擇合適的曝光條件，完成顯影并保存。（2）細(xì)胞增殖：采用BrdU-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取各組干預(yù)后12、24、36及48 h的細(xì)胞，以20 000/孔培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以梯度濃度CWE完成72 h處理，根據(jù)BrdU試劑盒說明，完成細(xì)胞的固定、沖洗，加入相應(yīng)的抗體、洗滌后顯色，在微孔板分光光度計(jì)上以450 nm波長(zhǎng)度數(shù)進(jìn)行測(cè)定[14]。（3）細(xì)胞侵襲能力：采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。取各組干預(yù)后的細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種在24孔板Transwell中，每孔中設(shè)置復(fù)孔5個(gè)，并且在上室加入200 μL DMEM∶F12培養(yǎng)基、下室加入600 μL DMEM∶F12培養(yǎng)基，并在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)完成48 h培養(yǎng)，吸取下室中培養(yǎng)液，加入結(jié)晶紫染色液100 μL/孔，連續(xù)完成10 min染色，染色完畢后采用PBS進(jìn)行2次洗滌，400倍顯微鏡下連續(xù)統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野的細(xì)胞并取平均值[15]。

1.3觀察指標(biāo)

①典型基因表達(dá)：記錄乏氧加抑制劑處理組、乏氧組、抑制劑處理組、對(duì)照組各典型基因的表達(dá)水平。②增殖率：記錄各組干預(yù)后12、24、36及48 h的細(xì)胞增殖率。③細(xì)胞侵襲率：記錄各組細(xì)胞干預(yù)后12 h的細(xì)胞侵襲率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組典型基因標(biāo)志表達(dá)比較

Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平分別為（0.32±0.05）、（0.41±0.08）、（0.35±0.06），低于乏氧組的（0.78±0.12）、（0.80±0.14）、（0.79±0.13），低于抑制劑處理組的（0.57±0.11）、（0.62±0.14）、（0.59±0.12），低于對(duì)照組的（0.60±0.13）、（0.69±0.16）、（0.67±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乏氧組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平高于抑制劑處理組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較

BrdU-ELISA法結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乏氧組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率高于抑制劑處理組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3各組細(xì)胞侵襲率比較

Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組細(xì)胞侵襲率為（58.56±5.67）%，低于乏氧組的（78.57±6.83）%，但明顯高于抑制劑處理組的（27.58±5.31）%與對(duì)照組的（37.59±7.21）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乏氧組細(xì)胞侵襲指數(shù)高于抑制劑處理組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是由大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變產(chǎn)生的、最常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的35.2%～61.0%，主要由膠質(zhì)細(xì)胞演化而來，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高及死亡率高等特點(diǎn)，影響患者的健康和生活。缺氧是腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的基本特征，持續(xù)的缺氧能促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[16]。而介導(dǎo)缺氧應(yīng)答的主要轉(zhuǎn)錄因子在腦膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后存在相關(guān)性[17]。目前，臨床對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的病因尚未明確，可能與腫瘤本身存在緊密聯(lián)系，其中主要包括病毒感染、化學(xué)、電磁輻射及環(huán)境等因素。臨床研究顯示，HIF-1α/HIF-1β轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的穩(wěn)定與活化激活下游靶基因，調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[18]。本研究中Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平低于乏氧組、抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05），乏氧組SMO、GLI1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05），說明Hedgehog通路在腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中呈高表達(dá)，且乏氧狀態(tài)下腫瘤轉(zhuǎn)移率最高，能加劇腫瘤的轉(zhuǎn)移。Hedgehog通路最早在研究果蠅基因突變時(shí)被發(fā)現(xiàn)，在脊椎動(dòng)物中其信號(hào)通路成員較多，如膜受體Ptch、配體Hh、Smo及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli。當(dāng)配體處于功能狀態(tài)時(shí)，Shh、Ptch結(jié)合接觸，能抑制Smo受體，從而引起下游轉(zhuǎn)錄因子激活，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖激活。而當(dāng)配體處于無功能狀態(tài)時(shí)，Ptch對(duì)受體能發(fā)揮良好的抑制作用，引起Gli發(fā)生水解、失效。因此，激活Hh對(duì)配體的發(fā)育具有重要的作用。本研究中BrdU-ELISA法的結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05），說明乏氧能促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而給予細(xì)胞抑制劑，則能在一定程度上抑制細(xì)胞的增殖。楊寧等[19]的研究結(jié)果顯示，N-Shh能刺激腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，而Hh信號(hào)通路特異性阻斷劑的干預(yù)可降低細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧加抑制劑處理組細(xì)胞侵襲率低于乏氧組，但明顯高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05），乏氧組細(xì)胞侵襲率高于抑制劑處理組與對(duì)照組（P<0.05），說明乏氧加抑制劑處理能降低腦膠質(zhì)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而乏氧則能促進(jìn)腦膠質(zhì)細(xì)胞的侵襲。姚軍利等[20]的研究顯示，阻斷Hh信號(hào)通路能抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，可能與Glil抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)有關(guān)，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Hedgehog通路可能通過SMO、GLI1調(diào)控EMT，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，在缺氧誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，能為腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移治療提供新的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-12-09）