響應面試驗優(yōu)化牛骨湯酶解工藝及其鈣含量分析

李玉昕，朱迎春，衛(wèi)云云，吉玉程

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西晉中030801）

膠原蛋白是骨湯中的重要成分[1]，通過酶解可以將其水解為膠原多肽和氨基酸，能夠有效提高膠原蛋白的吸收利用率[2-3]。此外，酶解液可顯著提高膠原蛋白的溶解性、保水性、熱反應力，降低水解液黏度[4]。

用作酶解骨膠原蛋白的酶主要有三類：植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶等）、動物蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶等）和微生物蛋白酶[5-8]。肖龍泉等[9]以水解度為指標，考察木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶對膠原蛋白的酶解效果。文旭娟等分析[10]了酶種類、濃度和時間對水解度（degree of hydrolysis，DH）、肽鏈長度及游離鈣含量的影響，并從中篩選出了最優(yōu)方案。劉小蕾[11]以水解度和三氯乙酸-氮溶解指數(shù)為評價指標，分別在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶4 種蛋白酶的最適條件下對豬骨湯進行酶解，篩選酶解骨湯的最佳單一酶和復配酶，并對其工藝進行了優(yōu)化。

牛骨中膠原蛋白質含量豐富，氨基酸比例均衡，此外還含有鈣、鈉、鎂、鉀、鐵等礦物元素和豐富的維生素[12]。在牛肉加工產(chǎn)業(yè)中，牛骨作為副產(chǎn)物往往被廢棄或加工成附加值較低的飼料用牛骨粉[13]。為充分利用牛骨資源，本試驗通過常壓蒸煮制得牛骨湯。為了提高膠原蛋白和鈣的利用率，試驗從3 種酶制劑中篩選最佳用酶，通過單因素試驗和響應面設計優(yōu)化其酶解工藝，并對骨湯中可溶出性鈣含量進行了分析，以期為牛骨湯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復合蛋白酶（1.2×105U/g）：上海金穗生物科技有限公司；風味蛋白酶（3×104U/g）、木瓜蛋白酶（8×105U/g）：四川樂山井研食品公司。

酚酞、乙醇、甲醛、NaOH 等試劑均為分析純：天津化學試劑一廠。

酸度計（PB-10）：瑞典Sartorius 公司；電子恒溫水浴鍋（ZKW-4）：常熟市天量儀器有限責任公司；電子天平（LT 100 型）：北京中興偉業(yè)公司；離心機（ST40R）：德國Theromo Scientific 公司；強力碎骨機（SGJ-360型）：廊坊市惠友機械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛骨湯熬制

將冷凍牛骨清水解凍，反復沖洗干凈，放入鍋中進行預煮，去除淤血和雜質等。溫水沖洗牛骨，利用碎骨機將其破碎成3 mm×3 mm 大小的塊狀。將處理好的小塊牛骨放入鍋中，以牛骨∶水=1 ∶3 質量比例熬制，大火熬制6 h[14]后換小火慢熬6 h，熬制過程中補足揮發(fā)的水分。雙層紗布過濾熬制好的牛骨湯，過濾兩次后4 ℃冷藏備用。

1.2.2 水解度測定

采用甲醛滴定法[15]。甲醛可與氨基酸的氨基結合，生成羥甲基衍生物，使氨基上的H+游離出來，可以用NaOH 標準溶液滴定釋放出的H+，測定氨基氮含量，計算游離氨基含量。計算公式如下：

式中：V 為樣品消耗NaOH 標準溶液的體積，mL；V0為 空 白 消 耗 NaOH 標 準 溶 液 的 體 積 ，mL；N 為NaOH 標準溶液的濃度，mol/L；14.008 為 1 mL 濃度為1.000 mol/L NaOH 標準液相當于氮的質量，mg。

1.2.3 鈣含量測定

將過濾后的牛骨清湯經(jīng)硝酸和高氯酸濕法消化處理后，采用乙二胺四乙酸滴定法測定鈣含量[16]。

1.3 試驗設計

1.3.1 最適酶制劑選擇

選擇風味蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶3 種酶對牛骨湯進行酶解，酶解條件如表1 所示。以牛骨湯中蛋白質的水解度為指標，篩選出最佳酶制劑。

表1 3 種蛋白酶酶解條件Table 1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis of three proteases

1.3.2 單因素試驗

試驗在確定最佳用酶的基礎上，以骨湯質量為基準，考察酶解 pH 值（7.0、7.3、7.6、7.9 和 8.2）、酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、酶解時間（2.0、2.5、3.0、3.5、4 h）、加酶量（0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%）對水解度的影響，并確定單酶水解條件的最適范圍。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert 8.0.6軟件，以蛋白質水解度為指標進行四因素三水平的響應面試驗。因素水平表如表2 所示。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 The level table of test factor in response surface

1.3.4 最佳酶解工藝條件下鈣含量的測定

取熬制后的牛骨湯測定游離鈣含量，最佳酶解條件酶解后測定其游離鈣含量，測定最佳酶解工藝條件下游離鈣的增加量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗均重復3 次，結果用平均值±標準偏差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1 軟件包（St Paul，MN）進行差異顯著性分析，采用Design-Expert8.0.6 軟件進行響應面分析，采用SigmaPlot 10.0 繪圖軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

表3 所示為3 種酶在其較適條件下的水解度。

表3 3 種酶最適條件下的水解度Table 3 Hydrolysis degree of the three enzymes under optimum conditions

由表3 可知，在同樣的酶解時間和加酶量下，復合蛋白酶水解度最大，顯著高于其他兩種酶（p＜0.05）。復合蛋白酶是由篩選的米曲霉菌株經(jīng)深層發(fā)酵生產(chǎn)的肽酶復合物，含有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種酶活力，其水解蛋白質的能力較強[17]，故選用復合蛋白酶作為后續(xù)研究的最適用酶。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 加酶量對水解度的影響

加酶量對牛骨湯水解度的影響如圖1 所示。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effects of different enzyme dosage on hydrolysis degree

由圖1 可知，加酶量在0.4%～1.0%時，牛骨湯的水解度顯著升高（p＜0.05），加酶量在1.0%～1.2%時，水解度升高速率變緩。這是因為隨著加酶量的增加，酶與底物的接觸面積增大，水解度顯著升高（p＜0.05）。但酶與底物接觸的面積是有限的，當酶與底物基本結合完全時，再增加用酶量，對水解度的影響不大[18-19]（p＞0.05）。考慮到經(jīng)濟成本，確定最適加酶量為1.0%。

2.2.2 酶解溫度對水解度的影響

酶解溫度對牛骨湯水解度的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對水解度的影響Fig.2 Influence of different enzymatic hydrolysis temperatures on hydrolysis degree

由圖2 可知，酶解溫度為45 ℃～55 ℃時，牛骨湯水解度逐漸升高，且在55 ℃達到最高值為2.87%，酶解溫度為55 ℃～65 ℃時，水解度有所下降。酶解反應時，酶解溫度非常重要，溫度上升加大了酶與底物蛋白之間發(fā)生碰撞的幾率，促進了酶促反應，但升溫超過酶所能承受的最大溫度時酶分子結構遭到破壞而喪失或部分喪失活性，酶促反應速率下降[20]。因此，確定最適酶解溫度為55 ℃。

2.2.3 pH 值對水解度的影響

圖3 為不同pH 值對牛骨湯水解度的影響。

圖3 不同pH 值對水解度的影響Fig.3 Effect of different pH on hydrolysis degree

由圖3 可知，pH 值為7.0～7.6 時，牛骨湯水解度顯著升高（P＜0.05），且在 pH 值為 7.6 時水解度達到最高值4.13%，pH 值為7.6～8.2 時，水解度下降。酶解反應時，酶只在一定pH 值范圍內發(fā)揮作用，pH 值過高或過低時都會使酶的活性降低[21]。因此，確定最適酶解pH 值為 7.6。

2.2.4 酶解時間對水解度的影響

不同酶解時間對牛骨湯水解度的影響見圖4。

由圖4 可知，酶解時間由2 h 增加到3.5 h 時，水解度逐漸升高并達到最高值4.48%。當酶解時間繼續(xù)延長時，水解度則變化不顯著（P＞0.05）。酶解過程中，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物也逐漸增加，但當酶解產(chǎn)物增加到一定量時會反過來抑制復合蛋白酶的活性[22]，從而使牛骨湯的水解度保持相對平穩(wěn)但略有降低。

圖4 不同酶解時間對水解度的影響Fig.4 Influence of different time on hydrolysis degree

綜上所述，單因素試驗中，復合蛋白酶的適宜酶解條件為加酶量1.0%、溫度55 ℃、pH 值7.6、酶解時間3.5 h。在此條件下，牛骨湯水解度為4.48%。

2.3 響應面試驗結果及分析

2.3.1 響應面試驗方案與試驗結果

在單因素試驗基礎上，選擇初始pH 值、酶解溫度（℃）、酶解時間（h）和加酶量（%）為自變量，水解度DH為響應值，通過Design-Expert 8.0.6 軟件設計出Box-Behnken 中心組合進行響應面試驗。試驗方案及結果見表4。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Response surface test design and results

續(xù)表4 響應面試驗設計與結果Continue table 4 Response surface test design and results

2.3.2 回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件進行多元回歸擬合后，得到回歸方程：水解度（Y）=4.90+0.12A-0.11B+0.042C+0.30D-0.005AB+0.047AC+0.10AD+0.095BC-0.045BD-0.050CD-0.56A2-0.80B2-1.02C2-0.18D2。

對回歸方程進行方差分析，結果見表5。

表5 方差分析結果Table 5 Results of variance analysis

由表5 可知：模型P＜0.000 1，模型極顯著。失擬項F 值為 4.30，P 值為 0.086 4（P＞0.05），不顯著，說明模型的擬合度很好。回歸模型的R2Adj=0.976 3，證明該回歸模型能很好的預測牛骨湯酶解工藝的結果。

該模型顯著性檢驗顯示，除了 C（pH 值）（P＞0.05）不顯著外，一次項 A（酶解時間）、B（酶解溫度）、D（加酶量）對水解度影響顯著（P＜0.05），比較 A、B、C、D 4個因素的F 值大小可知，4 個因素對水解度的影響依次為：加酶量＞酶解時間＞酶解溫度＞初始pH 值。

模型中二次項 A2、B2、C2極顯著（P＜0.000 1），D2為顯著（P＜0.01），交互項（AB、AC、AD、BC、CD）對水解度影響均不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 最佳工藝條件的確定與驗證

將酶解時間、酶解溫度、初始pH 值、加酶量的取值范圍分別設定為酶解時間3.0 h～4.0 h、酶解溫度50 ℃～60 ℃、初始 pH 值 7.3～7.9、加酶量 0.8%～1.2%，并將目標值設定為最大值，通過Design Expert 8.0.6 軟件獲得最優(yōu)組合為酶解時間3.53 h、酶解溫度53.01 ℃、初始pH 值7.60、加酶量1.16%。在此最優(yōu)組合中，理論最佳牛骨湯水解度為4.86%，根據(jù)實際條件的限制將最優(yōu)組合修正為酶解時間3.5 h、酶解溫度53 ℃、初始pH 值7.60、加酶量1.16%。此時得到4.83%，與預測值很接近。

2.4 酶解液游離鈣含量的測定結果

取熬制好的牛骨湯過濾后測定游離鈣含量為8.00 mg/100 mL，最優(yōu)條件酶解之后再次測定游離鈣含量為14.00 mg/100 mL。由此可見，通過酶解游離鈣含量增加了75%。

3 結論

試驗對比3 種蛋白酶對牛骨湯的酶解效果，篩選出酶解牛骨湯的最佳蛋白酶為復合蛋白酶。通過單因素試驗確定響應面試驗因素的水平，并通過Box-Behnken 中心組合試驗優(yōu)化其酶解工藝，得到牛骨湯最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：酶解時間為3.5 h，酶解溫度為53 ℃，酶解pH 值為7.60，加酶量為1.16%。在此條件下，所得牛骨湯酶解液水解度為4.83%，游離鈣含量從8.00 mg/100 mL 增加到14.00 mg/100 mL，增加了75%。