響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取黑芝麻黑色素的工藝

陳靜，丁潔，沙芮，洪妍，牛犇

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

近年來，黑色食品備受追捧，大量研究表明，黑色食品是具有抗氧化、延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤、降血脂、養(yǎng)血補腎、烏發(fā)美容等功效[1-2]，而黑色食品之所以會發(fā)揮這些作用，是由于它們本身所含有的黑色素，因此研究天然黑色素的提取及優(yōu)化提取方法具有深刻的應(yīng)用價值。

黑芝麻是脂麻科（胡麻科）脂麻屬的黑色種子，是世界上的主要油料作物之一。在亞洲、南美洲和中美洲的許多國家均有大量種植。我國是芝麻生產(chǎn)大國，因芝麻產(chǎn)量居世界之首，因而有“芝麻王國”之稱。黑芝麻黑色素就是一種天然黑色素，是一類安全、無毒的天然食用色素，具有重要的生物活性，同時也是黑芝麻中較強的抗氧化成分之一，具有良好的水溶性、光穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，耐氧化還原等優(yōu)良的物理性質(zhì)[3-4]。根據(jù)全血化學發(fā)光強弱作為抗活性氧大小的指標，黑芝麻色素對全血化學發(fā)光有較強的抑制作用，黑芝麻色素對細胞或非細胞體系所產(chǎn)生的活性氧都有較強的清除作用，提示它是黑芝麻成分中較強的自由基清除劑之一[5]。

據(jù)文獻報道，目前關(guān)于黑色素的提取方法主要有4 種：（1）堿溶酸沉法，根據(jù)黑色素溶于堿性溶液而不溶于酸性溶液的性質(zhì)，在堿性環(huán)境進行提取，然后酸化至酸性環(huán)境，使色素形成沉淀析出，即得到黑芝麻黑色素[6-8]；（2）醇提法，乙醇或酸性乙醇均作為黑色素的萃取溶劑[9-10]；（3）酶提法，Yu 等利用酶法從栗子殼中分離黑色素，將生物材料用蛋白酶進行連續(xù)酶促處理，如膠原酶、蛋白酶等，從而獲得栗子殼黑色素[11-12]；（4）酸提法，張沙艷和胡春霞從毛發(fā)中提取黑色素，將洗凈晾干的人發(fā)置于30 %的濃鹽酸中，在110 ℃～112 ℃條件下，加熱回流4 h，冷卻，收集濾渣，即得毛發(fā)黑色素粗提物[13]。考慮到此類天然黑色素均不能夠溶于常見的有機溶劑，同時不能溶于酸性溶液，而微溶于水，且易溶于堿性溶液。同時，之前學者所用堿溶酸沉法提取黑芝麻色素常見的萃取溶劑為NaOH 和鹽酸，均為強酸和強堿，本試驗嘗試使用碳酸氫鈉作為萃取溶劑對黑芝麻色素進行提取，碳酸氫鈉作為小蘇打可食用，提取所得的黑色素較為安全，可用作食品添加劑，因而具有更廣泛的應(yīng)用價值。

1 材料與儀器

1.1 材料

黑芝麻：產(chǎn)地云南；碳酸氫鈉：天津市化學試劑三廠。

1.2 儀器

METTLER AE100 型電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UPH-1-40L 優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；UV2300II 型雙光束紫外可見光光度計：上海天美科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑芝麻黑色素的提取工藝

準確稱取10 g 黑芝麻，水洗干凈后，濾干備用，配制8 g/L 碳酸氫鈉溶液（根據(jù)預試驗，嘗試了3 g/L～10 g/L 碳酸氫鈉溶液作為萃取溶劑，8 g/L 碳酸氫鈉溶液提取黑色素得率最高）作為萃取溶劑，pH 值為8.8。使用溶劑將芝麻浸沒后，在一定功率超聲波提取儀中進行攪拌提取，超聲結(jié)束后對溶液進行抽濾，將濾液放置于70 ℃烘箱進行烘干，即得黑芝麻黑色素，得率計算公式如下：

式中：D 為得率，%；m 為黑色素質(zhì)量，g；W 為黑芝麻質(zhì)量，g。

1.3.2 黑芝麻黑色素最大吸收波長的確定和色價的計算

取一定量提取的黑芝麻色素，用pH 值為8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置成一定濃度的溶液，使用紫外分光光度計對其進行全波長掃描，得到其最大吸收處波長λmax。精確稱取色素0.05 g，溶于pH值為8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，并定容至100 mL，搖勻。從中吸取1 mL 色素溶液，用同樣的緩沖溶液定容至10 mL。在λmax處測定稀釋后的色素溶液的吸光值，計算色價。色價的計算公式如下：

式中：E 為色階；A 為吸光值；n 為待測樣品稀釋倍數(shù)；W 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

黑芝麻10 g，水洗瀝干，以碳酸氫鈉溶液作為提取溶液，在提取溫度 30、40、50、60、70 ℃；超聲波提取功率 60 %、70 %、80 %、90 %、100 %（即 300、350、400、450、500 W）；提取時間 15、30、45、60、75 min；料液比1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）；進行攪拌提取，過濾，濾液放置70 ℃烘箱內(nèi)進行烘干，得黑芝麻黑色素，測定其吸光度，并計算黑色素得率和色價。

1.3.4 提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對料液比、提取溫度、提取時間和超聲功率四因素設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，以黑色素得率和色價為響應(yīng)面值，因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken 中心組合設(shè)計Table 1 Central composite design

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)處理及趨勢線由Excel 2010 計算得出；采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，并對試驗結(jié)果采用二次回歸模型進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑芝麻黑色素最大吸收波長的確定

黑芝麻黑色素的紫外可吸收光譜見圖1。

圖1 黑芝麻色素的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet visible absorption spectra of black sesame pigment

由圖1 可以看出黑芝麻色素的紫外光譜圖在波長為213 nm 下有最大吸收峰。故選擇以213 nm 為黑芝麻黑色素的最大吸收波長。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 料液比對黑芝麻色素提取的影響

固定超聲波提取功率為100%，提取溫度為40 ℃，提取時間為30 min，對色素提取情況進行分析。料液比對黑芝麻黑色素得率及色價的影響見圖2。

圖2 料液比對色素提取效果的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on pigment extraction

從圖2 可以看出，當料液比由 1 ∶3（g/mL）升至1 ∶5（g/mL）時，得率有顯著提高，當料液比為 1 ∶3（g/mL）時，芝麻溶于水中后沒有多余提取液，使得黑色素溶解不完全，提高料液比后黑色素得率明顯提升，而料液比由 1 ∶5（g/mL）升至 1 ∶7（g/mL）時，得率無明顯變化，說明黑色素的提取已達到平臺期；而隨著料液比的增加，色價呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，考慮到提取溶劑的用量及后續(xù)提取物的濃縮及烘干試驗，選取料液比為1 ∶5，響應(yīng)面中料液比的取值范圍為1 ∶4（g/mL）～1 ∶6（g/mL）。

2.2.2 提取溫度對黑芝麻色素提取的影響

固定超聲波提取功率為100%，料液比為1∶3（g/mL），提取時間為30 min，對色素提取情況進行分析。提取溫度對黑芝麻黑色素得率及色價的影響見圖3。

圖3 提取溫度對色素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on pigment extraction

從圖3 可以看出，隨著提取溫度的升高，色素得率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，當溫度由50 ℃繼續(xù)向上升時，得率基本維持不變。水分子是不斷運動的，溫度越高水分子運動速率越快，溶質(zhì)在溶液中的擴散速度就越快，所以黑色素溶解速率越快，但此時雜質(zhì)也更易溶出而且黑色素的分解也在加速，使黑色素純度降低，因而溫度超過60 ℃后色價開始降低，故選擇50 ℃作為提取溫度，響應(yīng)面設(shè)計試驗中溫度的選擇范圍為40 ℃～60 ℃。

2.2.3 提取時間對黑芝麻色素提取的影響

固定超聲波提取功率為100%，料液比為1∶3（g/mL），提取溫度為40 ℃，對色素提取情況進行分析。提取時間對黑芝麻黑色素得率及色價的影響見圖4。

圖4 提取時間對色素提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on pigment extraction

從圖4 可以看出隨著提取時間的延長，色素得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在提取時間為45 min 時，得率達到最高點。說明黑色素的溶出是一個漸進的過程，但隨著提取時間的增加，溶出的雜質(zhì)也會增多，影響純度。而色價隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先降后升的趨勢。考慮到色價和得率兩個因素，以及提取的時間成本，選擇提取時間為45 min，響應(yīng)面試驗中提取時間的范圍為30 min～60 min。

2.2.4 超聲功率對黑芝麻色素提取的影響

固定料液比為 1 ∶3（g/mL），提取溫度為 40 ℃，提取時間30 min，對色素提取情況進行分析。超聲功率對黑芝麻黑色素得率及色價的影響見圖5。

圖5 超聲功率對色素提取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on pigment extraction

從圖5 可以看出，隨著超聲功率的升高，色素得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在超聲功率為80%的條件下，色素得率達到最高點，而色價基本呈現(xiàn)增長趨勢，但同時考慮色價和得率兩個因素，選擇超聲功率80%為提取功率，響應(yīng)面試驗中提取功率的范圍為70%～90%。2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析2.3.1 回歸模型方差分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取時間、料液比、超聲功率和溫度4 個因素為自變量，以黑色素得率和色價為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6 進行四因素三水平的試驗設(shè)計，共包括29 個試驗點，其中24 個為析因點，5 個為零點以估計誤差。試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Design scheme and response value results

續(xù)表2 Box-Behnken 設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Continue table 2 Design scheme and response value results

利用Design-Expert8.0.6 軟件對結(jié)果進行分析，擬合得到黑色素得率及色階的多元回歸模型：

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3 和表4，料液比、超聲功率、提取溫度和時間對色價及得率有顯著正效應(yīng)，模型P 值均＜0.01，說明回歸模型極顯著。失擬項P 值均＞0.05，P 為不顯著，說明回歸模型顯著。決定系數(shù)R2分別為0.977 0 和0.983 3，均大于0.9，說明回歸模型擬合良好。

由表3 中各因素P 值的大小可知，提取時間和料液比對得率的影響極顯著，且提取時間與料液比、提取時間和超聲功率、提取時間和溫度、料液比和溫度的交互作用對得率的影響達到了極顯著的水平，各因素對得率的影響排序為A（時間）＞B（料液比）＞D（溫度）＞C（超聲功率）；由表4 中各因素P 值的大小可知，提取時間和溫度對色價的影響極顯著，且超聲功率和溫度的交互作用對色價的影響達到了極顯著的水平，各因素對色價的影響排序為A（時間）＞D（溫度）＞B（料液比）＞C（超聲功率）。

表3 二次回歸模型對得率的方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results of the quadratic regression model on receiving rate

表4 二次回歸模型對色價的方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis result of the quadratic regression model on the color price

2.3.2 因素交互作用分析

為了進一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點[14-15]，利用Design-expert 軟件分析二次回歸模型，繪制響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖。圖6～圖7 為響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖。

等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反，響應(yīng)曲線能直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響。圖6 為一種因素水平為0 時，另外兩因素對黑芝麻黑色素得率的交互作用。由圖6 可看出，圖6 中a、b、c、e 的等高線均為橢圓形，其中圖 6a 和圖 6b 的3D 曲面坡度最大，所以提取時間與料液比、提取時間與超聲功率、提取時間與溫度、超聲功率與溫度的交互作用對黑色素得率的影響極顯著，而料液比與超聲功率及超聲功率與溫度的交互作用對黑色素得率的影響不顯著。

圖6 各因素相互作用對黑色素得率的影響Fig.6 The effects of various factors on the melanin receiving rate

圖7 各因素相互作用對色價的影響Fig.7 The effects of various factors on the color price

圖7 為當一種因素水平為0 時，另外兩因素對色價的交互作用。由圖7 可看出，圖7 中僅圖7f 的等高線為橢圓形，即超聲功率與溫度的交互作用對色價的影響極顯著，其余各交互因素均對色價影響不顯著。

3.4 驗證試驗結(jié)果

對試驗模型進行分析得出超聲波提取黑芝麻黑色素的最佳工藝條件為提取時間45.15 min、料液比1 ∶5.05（g/mL）、超聲功率 79.97 %、超聲溫度 43.5 ℃，考慮到實際操作情況，將最佳試驗條件調(diào)整為提取時間 45 min、料液比 1 ∶5（g/mL）、超聲功率 80%、超聲溫度44 ℃，實際測得芝麻黑色素得率為4.438%，與理論值4.412 %相比誤差為0.59 %；色價為197.318，與理論值196.445 相比誤差為0.44%。因此本試驗得到的最優(yōu)條件準確可靠，具有一定的參考價值。

3 結(jié)果與討論

本試驗采用響應(yīng)面法來優(yōu)化黑芝麻黑色素提取工藝中提取溫度、提取時間、超聲功率及料液比4 個因素對黑色素得率及色價的影響。由此建立的多項回歸方程模型能較好的反應(yīng)實際提取效果，得到最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間 45 min，料液比 1 ∶5（g/mL），提取溫度44 ℃，超聲功率80%，最終提取黑芝麻黑色素的得率為4.438%，色價為197.318。

用碳酸氫鈉作為提取溶劑來提取黑芝麻中的黑色素，減少了強堿強酸對色素的影響，所得色素可放心地用于食品、保健品等可食用產(chǎn)物的生產(chǎn)工藝；同時，采用超聲波輔助提取法分離成分，相比加熱回流提取法，試驗周期短，操作簡單，是提取黑色素的可選途徑。運用此方法對芝麻黑色素進行提取可以有效提高生產(chǎn)效率、節(jié)約成本，為黑芝麻黑色素進一步研究提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。