酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝

鄭洪偉，馮佳，吳杰，王鑫彤，陳慧，王樂，曹曦，張菲，郭雷，2，*

（1.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港 222004）

微生物活動是引起生鮮水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。冷藏是延長水產(chǎn)品貨架期的最常用的方法，但仍有少數(shù)微生物能在低溫下生存繁殖并產(chǎn)生腐敗異味和臭味的代謝產(chǎn)物，這樣的微生物稱之為特定腐敗菌[1-2]。研究表明，在有氧冷藏條件下，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是大黃魚、帶魚和南美白對蝦等水產(chǎn)品冷藏過程中特定腐敗菌之一[3-4]。腐敗希瓦氏菌歸屬于弧菌科希瓦氏菌屬（Shewanella），是嗜冷性的革蘭氏陰性運(yùn)動桿菌，其能把氧化三甲胺還原為三甲胺，產(chǎn)生硫化氫，腐敗時(shí)出現(xiàn)酸臭味等異味，最終導(dǎo)致水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[5]。

中草藥因其不易產(chǎn)生抗藥性、藥物殘留低、毒副作用小，在替代抗生素資源開發(fā)方面引起了越來越多的重視和關(guān)注[6-7]。五倍子為漆樹科植物鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）、青麩楊（Rhus potaninii Maxim.）或紅麩楊（Rhus punjabensis Stew.var.sinica （Diels）Rehd.et Wils.）葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜（Melaphis chinensis（Bell）Baker）寄生而形成[8]。五倍子是我國傳統(tǒng)中藥之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、防齲、抗癌、護(hù)肝、止瀉、抗炎、抗凝血等活性，已被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的防治[9-11]。五倍子的主要化學(xué)成分為鞣質(zhì)和沒食子酸。鞣質(zhì)又稱鞣酸、單寧酸，是五倍子的主要成分，含量可達(dá)70%[12]。五倍子鞣質(zhì)是一混合物，是一分子葡萄糖與1～10 個(gè)分子的沒食子酸縮合而成[13-14]。沒食子酸是五倍子的主要有效成分，在五倍子中的含量約為2%～4%，其可通過水解五倍子鞣質(zhì)而得[15-16]。

本研究對酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)過程中影響五倍子提取液抗菌活性的4 個(gè)主要影響因素（鹽酸濃度、酸解溫度、酸解時(shí)間和液料比）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對酸解法制備五倍子抗菌物質(zhì)的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步鑒定和開發(fā)五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五倍子：安徽亳州中藥廠，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩備用；腐敗希瓦氏菌QL-1（Shewanella putrefaciens），由江蘇海洋大學(xué)微生物天然產(chǎn)物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QJ32W1000A 型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市榮華儀器制造有限公司；DUG-9240D 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS 124S 電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GL25M 型低溫高速離心機(jī)：金壇區(qū)金城春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；CCA-20 型低溫冷卻水循環(huán)泵：上海一凱儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限公司，YXQ-LS 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中分別考察鹽酸濃度、酸解溫度、酸解時(shí)間和液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響。

鹽酸濃度：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，各加入 2、3、4、5、6 mol/L 的鹽酸溶液 20 mL，搖勻，使鹽酸與五倍子粉末充分混合，于80 ℃水浴酸解3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，上清液即為五倍子提取液。取上清液測定抗菌活性。

酸解溫度：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并加入3 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，混合均勻，分別于 60、70、80、90、100 ℃水浴酸解 3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

酸解時(shí)間：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并加入3 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，混合均勻，于100 ℃水浴分別酸解 1、2、3、4、5 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

液料比：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并分別加入 3 mol/L 的鹽酸溶液 10、20、30、40、50 mL，混合均勻，于100 ℃水浴酸解3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用酸解溫度100 ℃，以鹽酸濃度、酸解時(shí)間和液料比為設(shè)計(jì)的3 個(gè)變量，五倍子提取液的抗菌活性為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)的Box-Behnken 設(shè)計(jì)（表1）。利用Design Expert 7.0 軟件構(gòu)建模型、分析方差及預(yù)測最優(yōu)值[17]。

1.3.3 抗菌活性的測定

利用瓊脂擴(kuò)散法測定五倍子提取液的抗腐敗希瓦氏菌活性[18]。將冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑約90.00 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿加20mL 左右。培養(yǎng)基凝固后，取200μL1×106個(gè)/mL～2×106個(gè)/mL 腐敗希瓦氏菌液均勻涂布于培養(yǎng)基上，放置20 min。然后在培養(yǎng)皿內(nèi)放置牛津杯，將200 μL 待測液加入牛津杯內(nèi)，32 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，試驗(yàn)平行進(jìn)行3 次，抗菌活性大小以抑菌圈直徑的平均值（mm）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鹽酸濃度對五倍子提取物抗菌活性的影響

鹽酸濃度對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖1所示。

圖1 鹽酸濃度對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.1 Effect of concentration of HCl on actibacterial activity of the extracts of Galla chinensis（GCE）

從圖1 可以看出，當(dāng)鹽酸濃度在3 mol/L～4 mol/L時(shí)，五倍子提取液的抗菌活性保持在較高水平，因此在其他的單因素試驗(yàn)中，采用3 mol/L 的鹽酸溶液進(jìn)行酸解。

2.1.2 酸解溫度對五倍子提取物抗菌活性的影響

酸解溫度對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖2所示。

圖2 溫度對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on actibacterial activity of GCE

從圖2 可以看出，隨著溫度的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，100 ℃時(shí)最大，因此將酸解溫度定為100 ℃。

2.1.3 酸解時(shí)間對五倍子提取物抗菌活性的影響

酸解時(shí)間對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖3所示。

圖3 時(shí)間對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.3 Effect of time on actibacterial activity of GCE

從圖3 可以看出，隨著時(shí)間的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，4 h～5 h 時(shí)趨于穩(wěn)定，因此將3、4、5 h 定為響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)酸解時(shí)間的3 個(gè)水平。

2.1.4 液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響

液料比對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖4所示。

圖4 液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.4 Effect of liquid/material ratio on actibacterial activity of GCE

從圖4 可以看出，隨著液料比的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，液料比為50（mL/g）時(shí)抗菌活性最強(qiáng)，因此將 40、50、60（mL/g）作為響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)液料比的3 個(gè)水平。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酸解溫度定為100 ℃，以鹽酸濃度（2、3、4 mol/L）、時(shí)間（3、4、5 h）和液料比[40、50、60（mL/g）]為響應(yīng)面法優(yōu)化的 3 個(gè)因素及 3 個(gè)水平，五倍子提取液的抗菌活性為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行總共17個(gè)試驗(yàn)的Box-Behnken 設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)變量因素的編碼值、實(shí)際值及其響應(yīng)值如表1 所示。利用Design Expert 7.0 軟件進(jìn)行模型構(gòu)建和方差分析見表2。通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得出反映測試變量與響應(yīng)變量關(guān)系的二階多項(xiàng)式方程：

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 1 Coded（actual）levels of the operational parameters and observed values of Box-Behnken design

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA for the quadratic response surface model

從表2 可以看出，模型的P 值小于0.05，而失擬項(xiàng)的P 值大于0.05，說明構(gòu)建的模型是顯著的，并且能用于變量優(yōu)化的預(yù)測。液料比、鹽酸濃度與溫度的交互作用和鹽酸濃度的二次項(xiàng)達(dá)到顯著水平，時(shí)間的效應(yīng)達(dá)到極顯著水平，測試變量對響應(yīng)變量的影響效應(yīng)也可從其兩兩交互作用的響應(yīng)面圖進(jìn)行觀察（圖5）。通過對上述方程進(jìn)行回歸分析，模型預(yù)測的最佳工藝為鹽酸濃度4 mol/L、時(shí)間5 h 和液料比45 mL/g，預(yù)測的抗菌活性為22.63 mm。在最佳酸解工藝下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，五倍子提取液的實(shí)際抗菌活性為（23.68±0.68）mm（n=4），與預(yù)測值沒有顯著差異，說明響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝是可行的。

圖5 兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface plots for the interactions of two variables on actibacterial activity of GCE

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)、Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法對酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最佳的酸解工藝為：鹽酸濃度4 mol/L、液料比45 mL/g、溫度100 ℃時(shí)提取5 h。五倍子提取液的實(shí)際抗菌活性為（23.68±0.68）mm，與預(yù)測值（22.63 mm）沒有顯著差異，表明響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝是可行的。本研究為進(jìn)一步鑒定和開發(fā)五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)提供了依據(jù)。