檸檬酸處理對乳清分離蛋白凝膠特性的影響

陳琨，李桐，劉俐璐，李園園，姜瞻梅

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

乳清蛋白（whey protein，WP）是乳清中多種蛋白質組分的統稱，根據提取蛋白質的加工過程不同，可得到不同組成的乳清蛋白產品，如乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）是蛋白含量為34%～86%的商業產品，而經過進一步處理所得到的乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白質含量通常大于90%。乳清蛋白富含多種成分，包括β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白和乳過氧化物酶等，是一種營養豐富且易消化吸收的蛋白質[1-2]，有利于保持身體健康、提高免疫力、增強骨質和控制體重等，且乳清蛋白方便獲取、價格低廉，適合用作食品基料，在制藥、化學等其他許多領域都具有良好的應用價值[3]。

乳清分離蛋白具有多種功能特性，如溶解性、起泡性、凝膠性和乳化性等，因而適用于食品加工體系中。其中，凝膠特性是乳清蛋白的重要特性之一，它在許多食品的制備中都起著主要作用，如酸奶、果凍等，同時利用這種特性也可以將其作為增稠劑、微膠囊壁材等[4-6]。因此，不斷探究各種因素對乳清分離蛋白凝膠性的影響，并提高乳清分離蛋白的凝膠特性從而擴大其在食品及其他領域的應用，具有重要的社會經濟價值。近年來，隨著科學技術的不斷發展，國內外應用交聯技術對乳清分離蛋白進行改性的研究日益增多，其方法主要包括酶交聯[7]、化學交聯[8]等。其中化學交聯具有操作簡便、反應快速等特點，因而在快速高效的基礎上致力于開發安全的化學方法逐漸成為研究的熱點。

檸檬酸（citric acid，CA），又名枸櫞酸，因其具有愉悅的酸味，口感酸爽、安全無毒，被廣泛用作酸味劑，特別是在食品和飲料中[9]。近年來，應用檸檬酸作為一種安全高效、價格低廉的交聯劑，已經逐漸得到人們的關注。通過添加檸檬酸作為交聯劑，促使乳清蛋白分子間產生一些新的酰胺鍵及二硫鍵，進而形成蛋白質交聯。與此同時在疏水和范德華力的相互作用下，進一步促進了加熱后凝膠結構的形成及凝膠特性的改善?？琢罹闧10]探究將檸檬酸用于淀粉和小麥醇溶蛋白的交聯，通過十二烷基硫酸鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）等方法證明，檸檬酸交聯小麥醇溶蛋白的發生，也驗證了檸檬酸交聯可提高小麥醇溶蛋白的斷裂強度；Bagheri 等[11]使用檸檬酸對乳清蛋白進行預交聯處理，再通過乙醇脫溶劑產生蛋白顆粒，結果發現交聯后形成的蛋白顆粒具有較好的消化穩定性。許多研究已表明檸檬酸可用于蛋白質的交聯，并改善其部分功能特性，但是目前國內對檸檬酸處理改善乳清分離蛋白凝膠特性的研究還不全面。本研究以凝膠硬度和保水性為指標，探究檸檬酸處理對乳清蛋白的凝膠特性的影響，并在單因素試驗基礎上，應用響應面法進一步確定檸檬酸濃度及乳清分離蛋白濃度對其凝膠特性的交互作用，確定最優凝膠條件，致力于通過一種快速高效、安全無毒的化學方法改善乳清分離蛋白的凝膠特性，并為食品工業獲得新型、安全、高效的乳清分離蛋白功能性基料提供基本理論數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（蛋白質含量93.5%）：美國Mullins Whey Inc.公司；檸檬酸（≥99.5%）：上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TAXT-plus 質構分析儀：英國 SMS 公司；TGL20M高速冷凍離心機：百密思儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白交聯樣品的制備

將乳清分離蛋白（WPI）粉末溶解于去離子水中，在25 ℃下攪拌2 h，并在4 ℃下儲存過夜以確保完全溶解。然后將其配制成蛋白質濃度為4%、6%、8%、10%、12%的溶液，即獲得乳清蛋白溶液。向配制好的乳清蛋白溶液中添加檸檬酸，使其最終濃度分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，完全溶解后使用飽和氫氧化鈉溶液調節混合液的pH 值至7.0，然后50 ℃條件下反應6 h；反應后將混合液冷卻。

1.3.2 乳清蛋白凝膠特性的測定

將相同蛋白濃度、不含檸檬酸的WPI 溶液作為對照組；檸檬酸處理的WPI 溶液作為樣品組。將對照組和樣品組同時置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱30 min，隨后取出冷水浴冷卻至25 ℃已形成凝膠。在4 ℃下放置24 h，備用。

用TAXT-plus 質構儀對凝膠硬度進行測量，采用P/0.5 探頭。為避免破壞凝膠，測量時不要將凝膠從稱量皿中移出。探頭以2 mm/s 的速度穿刺，壓縮比例為50%。將整個過程中的最大力定義為凝膠強度。數據對3 個平行樣進行重復測定。

將凝膠均勻切成小塊，取出一定量的凝膠進行稱量，質量記作m，并置于50 mL 離心管中。記錄離心前離心管總質量m1。以8 000 r/min 在4 ℃條件下離心30 min。離心后離心管中的水倒出再進行稱量，離心管總質量記作m2。保水性按下式計算：

式中：m1為離心前凝膠和離心管總質量，g；m2為離心并排水后凝膠和離心管總質量，g；m 為凝膠質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

研究乳清蛋白濃度（4%、6%、8%、10%、12%）和檸檬酸濃度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）對乳清蛋白凝膠特性的影響，將凝膠硬度和凝膠保水性作為觀測指標。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以乳清蛋白濃度、檸檬酸濃度為自變量，凝膠強度和凝膠保水性分別為響應值，應用Design-Expert8.0 軟件設計試驗，如表1 所示，并進行二因素五水平的響應面法分析試驗，然后通過分析得到最優凝膠條件。

表1 響應面試驗因素及編碼水平Table 1 Factors and coding levels of response surface experiment

1.4 統計分析

本研究均進行3 次獨立重復試驗，將所得結果取平均值并利用SPSS 22.0 軟件對所有數據進行單因素方差分析，將P＜0.05 認為差異顯著。利用Excel（2010）作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乳清蛋白濃度對凝膠硬度的影響

本研究選取在檸檬酸（CA）濃度為1%的條件下，探究不同乳清蛋白濃度對其處理后所形成凝膠硬度影響，其試驗結果如圖1 所示。

圖1 乳清分離蛋白濃度對凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of WPI concentration on gel hardness

由圖1 可以看出，檸檬酸處理后的乳清蛋白其凝膠性顯著提高，且乳清蛋白濃度對凝膠硬度也有顯著影響（P＜0.05）。結果顯示，在蛋白質濃度為4%、6%、8%時，未經處理的乳清蛋白經過加熱處理未能形成凝膠；對比經過檸檬酸處理處理的乳清蛋白，其在各種濃度下均能形成凝膠，其凝膠硬度顯著增大。同時，凝膠硬度隨著蛋白質濃度的增加而顯著增加，當乳清蛋白濃度為12%時，凝膠硬度最大，達到1 284.40 g。崔旭海等在探究環境條件對乳清蛋白凝膠特性的影響時也發現，在蛋白濃度為4%～14%的范圍內隨著乳清蛋白濃度的增高其凝膠硬度也隨之增高[12]。分析其原因，推測是由于檸檬酸的加入使得乳清蛋白發生交聯，蛋白質中的氨基和交聯劑檸檬酸中的羧基發生親核取代反應，氨基氮攻擊具有部分正電荷的羰基碳進而形成新的酰胺鍵，檸檬酸的多個羧基參與反應使得蛋白質發生交聯[13]，形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝膠網絡結構。而均勻致密的微觀結構可能更易于與蛋白質凝膠中的水結合，有助于增強凝膠強度和保水性[14]，因此本研究中檸檬酸處理使得WPI 的凝膠硬度增加。同時，隨著蛋白質濃度的增加，參與凝膠作用的蛋白質分子也隨之增多，使得參與形成三維凝膠網絡的蛋白質增多進而有助于凝膠硬度增大[15]。

2.1.2 乳清蛋白濃度對凝膠保水性的影響

本研究選取在檸檬酸（CA）濃度為1%的條件下，探究不同乳清蛋白濃度對其處理后所形成凝膠保水性的影響，其試驗結果如圖2 所示。

圖2 乳清分離蛋白濃度對凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of WPI concentration on water holding capacity of gel

由圖2 可以看出，檸檬酸處理后的乳清蛋白其凝膠性顯著提高，且乳清蛋白濃度對凝膠保水性也有顯著影響（P＜0.05）。結果顯示，在蛋白質濃度為4%、6%、8%時，未經處理的乳清蛋白經過加熱處理未能形成凝膠；而經過檸檬酸處理的乳清蛋白，其在各種濃度下均能形成凝膠，對比可知其在蛋白質濃度為10 %和12%所形成凝膠的保水性均顯著提高。同時，凝膠保水性隨著蛋白質濃度的增加而顯著增加，當乳清蛋白濃度為12%時，凝膠保水性最好，達到76.33%。蛋白凝膠的持水性取決于凝膠網絡結合水的能力[16]。分析原因，由于檸檬酸的加入使得乳清蛋白發生交聯并形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝膠網絡結構，同時，隨著蛋白質濃度的增加，參與凝膠作用及形成三維凝膠網絡的蛋白質增多，形成更均勻和更致密的凝膠網絡，其具有更小的孔隙，其可以結合更大量的水并且有助于水分的截留，由此改善了凝膠的保水性[17]。

2.1.3 檸檬酸濃度對凝膠硬度的影響

本研究選取在WPI 濃度為10%的條件下，探究不同檸檬酸濃度對交聯后乳清蛋白所形成凝膠硬度的影響，其試驗結果如圖3 所示。

圖3 不同檸檬酸濃度下凝膠硬度的變化Fig.3 Effect of CA concentration on gel hardness

由圖3 可以看出，乳清蛋白凝膠硬度隨著檸檬酸濃度的增加而先上升后下降，且檸檬酸濃度對凝膠硬度影響效果顯著（P＜0.05），在檸檬酸濃度為0.6%時，凝膠硬度達到最大，為1 059.36 g。

檸檬酸濃度較小時，凝膠硬度隨著檸檬酸濃度的增加而增加，分析其原因是檸檬酸交聯乳清蛋白形成大分子聚合物，參與形成凝膠網絡的大分子物質有助于形成致密的凝膠結構進而增加凝膠硬度。隨著檸檬酸濃度的增加，使得樣品溶液中的離子強度不斷升高，檸檬酸在交聯蛋白質的同時，也通過靜電屏蔽作用使蛋白質分子聚集，使之形成三維網絡結構[18]，而在參與交聯的乳清蛋白數量有限的情況下，過多檸檬酸的加入可能使得靜電排斥力增加，因此使得所形成凝膠的強度有所下降。

2.1.4 檸檬酸濃度對凝膠保水性的影響

本研究選取在WPI 濃度為10%的條件下，探究不同檸檬酸濃度對處理后乳清蛋白所形成凝膠保水性的影響，其試驗結果如圖4 所示。

圖4 不同檸檬酸濃度下凝膠保水性的變化Fig.4 Effect of CA concentration on water holding capacity of gel

由圖4 可以看出，檸檬酸處理的乳清蛋白其凝膠保水性顯著提高（P＜0.05），但隨著檸檬酸濃度的升高其凝膠保水性下降。在檸檬酸濃度為0.3%時，凝膠保水性最好，達到97.23%。這可能由于檸檬酸處理乳清蛋白形成大分子聚合物，參與形成凝膠網絡的大分子物質有助于形成更加致密的凝膠結構，同時，由于細密的凝膠網絡的微小孔隙和可用于與水相互作用的更多位點，凝膠保水性得到改善，這些位點是包含在WPI-CA 產物中的檸檬酸殘基的游離羥基[19]。但是隨著檸檬酸濃度的增加，可能在蛋白質之間建立了較多共價鍵降低了蛋白質鏈的柔韌性并且具有更少的鏈間空間[20]，同時樣品溶液中的離子強度不斷升高，凝膠相互結合不緊密，導致結合水的能力下降[21]。

2.2 響應面法優化凝膠工藝條件

2.2.1 響應面法試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，以乳清蛋白濃度、檸檬酸濃度兩個因素為響應因素，以凝膠硬度和保水性為響應值，響應面試驗設計及結果（取平均值）如表2 所示。

表2 中心復合試驗設計及結果Table 2 Central composite test design and results

2.2.2 回歸模型的建立與分析

采用Design Expert 8.0 軟件對表2 中的數據進行多元回歸擬合分析和顯著性檢驗，建立的凝膠硬度、保水性與各因素變量的二次方程模型為：

凝膠硬度：Y1=601.17A-24.80B-226.77AB-39.31A2-228.05B2+1 261.76

保水性：Y2=-0.033A-0.10B+0.014A2+0.009 5B2+0.046AB2+0.75

凝膠硬度回歸模型方程的方差分析如表3 所示。

表3 凝膠硬度回歸模型方程的方差分析Table 3 Variance analysis of gel hardness regression model equations

由表3 的凝膠硬度回歸模型方程的方差分析可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯?；貧w方程模型的F 值為173.28，P 值小于0.01，這表明此回歸方程模型極顯著。失擬項P 值為0.245 3 大于0.05，表明失擬項不顯著。該模型R2=0.992 0，R2adj=0.986 3，說明模型與試驗擬合度較高，響應值與響應因素線性關系顯著。

凝膠保水性回歸模型方程的方差分析如表4 所示。

表4 凝膠保水性回歸模型方程的方差分析Table 4 Variance analysis of gel water holding capacity regression model equations

由表4 的凝膠保水性回歸模型方程的方差分析可知，因變量與自變量之間的線性關系明顯?；貧w方程模型的F 值為28.41，P 值小于0.01，這表明此回歸方程模型極顯著。該模型R2=0.953 0，R2adj=0.919 5，說明模型與試驗擬合度較高，響應值與響應因素線性關系顯著。

2.2.3 響應面分析

兩因素對凝膠硬度影響的響應面圖見圖5。

圖5 蛋白質濃度與檸檬酸濃度對乳清蛋白凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the hardness of WPI gel

如圖5 所示，在較低的檸檬酸濃度范圍內，隨著蛋白質濃度的升高，凝膠強度呈逐漸升高的趨勢；但是在較高的檸檬酸濃度下，隨著WPI 濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。在WPI 濃度為12%時，隨著檸檬酸濃度逐漸增加，WPI 凝膠硬度有逐漸降低的趨勢。在檸檬酸濃度較低時，蛋白質濃度較高時具有最高的凝膠保水性，兩因素具有顯著的相互作用，乳清蛋白對處理后凝膠硬度的影響更大。

兩因素對凝膠保水性影響的響應面圖見圖6。

圖6 蛋白質濃度與檸檬酸濃度對乳清蛋白凝膠保水性的影響Fig.6 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the water holding capacity of WPI gel

如圖6 所示，隨著蛋白質濃度的增加，WPI 的凝膠保水性呈上升趨勢；隨著檸檬酸濃度的增加，WPI 的凝膠保水性呈下降趨勢，且下降速率減緩。乳清蛋白濃度與檸檬酸濃度具有共同作用，乳清蛋白的作用更加有效，在檸檬酸濃度較低時，蛋白質濃度較高時具有最高的凝膠保水性。

2.2.4 回歸模型的驗證與對照試驗

利用軟件尋優，得到的具有最佳凝膠特性的工藝條件為蛋白質濃度為12%、檸檬酸濃度為0.3%，將混合溶液在50 ℃條件下水浴6 h。在此條件下由響應面模型預測的WPI 的凝膠硬度和保水性分別為1 847.14 g、89.021 9%。為檢驗回歸模型的可靠性，采用優化得出的工藝條件進行3 次驗證試驗，結果得到的WPI 的凝膠硬度為1 813.82 g，保水性為88.56%。與模型預測值非常接近，表明此模型有效，驗證了響應面模型的正確性。對比不加入檸檬酸、蛋白質濃度為12%，其他條件相同的情況下，得到的WPI 的凝膠硬度為15.7 g，保水性為37.68%，可知此檸檬酸處理方法對WPI 的凝膠特性有較大提高。

3 結論

本研究嘗試使用檸檬酸處理提高乳清蛋白的凝膠特性，通過單因素試驗和兩因素五水平的中心復合響應面試驗設計探究檸檬酸濃度和乳清蛋白濃度對其凝膠特性的影響，并預測出最佳優化條件。通過驗證試驗后，結果表明具有最佳凝膠特性的檸檬酸處理乳清蛋白條件為蛋白質濃度為12%，檸檬酸濃度為0.3%；在該條件下，制得的凝膠硬度為1 813.82 g，保水性為88.56%，與模型預測值1 847.14 g、89.021 9%相近。同時，對比未處理乳清蛋白，最優條件下的檸檬酸處理可以顯著改善其凝膠特性。