胃癌組織中miR-106b、BTG3的表達變化及意義

楊儉，薛輝，穆素恩，艾蓉，范紅偉

石家莊市第一醫院，石家莊050031

胃癌是起源于胃黏膜上皮的消化系統惡性腫瘤，具有進展快、惡性程度高及預后差等特點，嚴重威脅人們生命安全。據循證醫學統計，我國是胃癌高發國家，每年新發和死亡的胃癌患者數量均占世界的40%[1]。由于胃癌早期診斷困難，多數患者確診時已進展到中晚期。盡管手術或放化療等治療方式可以適當延長胃癌患者生命，但其預后仍較差且5年存活率不足10%[2]。微小RNA(miRNA)是真核生物中普遍存在的小分子單鏈RNA，其長度約為22個核苷酸，具有非編碼性和高度保守性，能夠調節mRNA的降解并抑制轉錄后翻譯水平[3]。miR-106b位于染色體7q22.1，參與調控細胞周期、DNA復制以及細胞凋亡等過程[4]。既往研究表明，miR-106b在胃癌組織中異常表達，能夠促進癌細胞增殖、侵襲以及遷移，但其在胃癌組織中的具體作用機制少見報道[5]。B細胞轉位基因3(BTG3)是一種抑癌基因，屬于酪氨酸激酶受體2(ErbB2)基因傳導體家族，對調節細胞分化、細胞周期及抑制癌細胞無限增殖等具有重要作用[6]。當細胞內DNA發生損傷或受生長因子刺激時BTG3表達明顯上調，且在G1/S過渡期達最高峰，從而抑制細胞不斷增殖[7]。本研究探討胃癌組織中miR-106b、BTG3的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2017年3月～2019年3月本院收治的103例胃癌患者臨床資料，男57例、女46例，年齡43～69(55.26±4.34)歲，腫瘤直徑≤5 cm 58例、>5 cm 45例，有淋巴結轉移21例、無淋巴結轉移82例，高分化52例、中分化39例、低分化12例、有脈管癌栓27例、無脈管癌栓76例，TNM分期Ⅰ期35例、Ⅱ期43例、Ⅲ期19例、Ⅳ期6例。納入標準：均符合《胃癌診斷標準》[8]中相關診斷標準，且經術后病理檢查證實為胃癌；臨床病理資料完整，且愿意配合研究；均首次診斷為胃癌，且胃部無既往手術史或放化療史。排除標準：直腸癌、肝癌及胰腺癌等惡性腫瘤；胃穿孔、胃間質瘤及胃淋巴瘤等胃部疾病；先天免疫功能缺陷或其他遺傳性疾病；嚴重肝腎功能障礙。本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過，且患者均簽署知情同意書。

1.2 胃癌組織及其癌旁正常組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達檢測 于術中采集胃癌組織及其癌旁(距腫瘤邊緣>5 cm)正常組織，均用液氮保存，術后統一放入-80 ℃冰箱中保存。采用實時熒光定量PCR技術。各取組織60 mg，分別加入TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)1 mL提取總RNA。應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒，將15 μg總RNA反轉錄為cDNA。反應條件均為16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。選用TaKaRa公司生產的SYBR Premix Ex Taq 試劑盒定量檢測miR-106b、BTG3的表達。miR-106b的上游引物序列為5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，內參基因U6的上游引物序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′、下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；BTG3的上游引物序列為5′-TGTGCTGTCGGTATGGAGAG-3′、下游引物序列為5′-TCTGGTACACAGGACTTGCG-3′，內參基因GAPDH的上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸30 s共45個循環。以上引物均由上海生工公司合成生產，且每個樣本均檢測3次。使用U6和GAPDH作為內參基因，應用相對Ct值法評估不同樣品的 Ct值，miR-106b和BTG3的表達量相對于GAPDH和U6的比值為2-ΔΔCt，其中 Ct=C目的基因-Ct內參基因。

2 結果

2.1 胃癌組織及其癌旁正常組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達比較 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-106b相對表達量分別為4.56±1.02、1.26±0.32，BTG3 mRNA相對表達量分別為0.57±0.14、1.21±0.37。胃癌組織中miR-106b相對表達量較癌旁正常組織高(t=31.329，P=0.000)，BTG3相對表達量較癌旁正常組織低(t=16.419，P=0.000)。

2.2 胃癌組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織中miR-106b的表達與胃癌淋巴結轉移、脈管癌栓、TNM分期有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小、分化程度無關(P均>0.05)。胃癌組織中BTG3 mRNA表達與脈管癌栓、TNM分期有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度無關(P均>0.05)，見表1。

表1 胃癌組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中miR-106b與BTG3 mRNA表達的相關性 胃癌組織中miR-106b表達與BTG3表達呈負相關(r=-0.681，P=0.003)。

3 討論

據流行病學調查統計，我國胃癌的發病率和病死率均位居世界前列，且呈逐年增長趨勢[9]。除飲食習慣、地域差異以及感染等因素外，表觀遺傳和多基因遺傳是導致胃癌發生和進展的重要因素[10]。目前，臨床多采用手術聯合化療為主的綜合治療模式，其中化療主要包括術前新輔助化療和聯合靶向藥物治療，但是多項前瞻性臨床試驗的結果表明其療效仍較差[11]。近年來，日趨成熟的基因測序技術幫助人們深入認識基因在疾病中的重要作用，miRNA、ErbB2以及長鏈非編碼RNA等的功能顛覆了人們的既往認知。多項研究均表明，這些基因能夠調控細胞增殖、分化和凋亡且改變細胞周期;同時，這些基因的異常表達能夠導致癌癥易感性增加[12,13]。

miRNA屬于非編碼RNA，可調節mRNA的穩定性和翻譯效率，并且能夠降解mRNA，在遺傳信息表達過程中起重要調控作用[14]。miR-106b-25基因簇位于染色體7q22 Mcm7基因內含子13上，包括miR-106b、miR-25及miR-93三種基因，其中miR-106b在肺癌等多種惡性腫瘤中過度表達，參與各種癌細胞增殖、侵襲以及轉移等過程[4]。本研究結果表明，胃癌組織中miR-106b的表達較癌旁正常組織升高。分析原因，可能由于癌組織中轉錄因子E2F1表達上調，進而誘導微小染色體維持蛋白7過度表達，激活原癌基因，最終直接促進胃癌細胞中miR-106b表達提高[15,16]。本研究顯示，胃癌組織中miR-106b的表達與淋巴結轉移、TNM分期以及脈管癌栓有關，表明miR-106b不僅能夠促進胃癌進展，而且可以反映胃癌的轉移情況，對評估患者病情具有重要意義。其機制可能為miR-106b能夠使Myc基因/轉錄因子E2F1/轉化生長因子β信號網絡發生功能紊亂，抑制激酶抑制劑p21和促凋亡因子Bim，改變癌細胞的細胞周期且不斷累積受損DNA，最終促進腫瘤的分化、浸潤以及轉移[17]。

BTG3屬于B細胞遷移基因/ErbB2轉錄因子家族(BTG/Tob)，其N端通過結合E2F1蛋白，阻礙DP1和E2F1轉錄因子結合DNA，進而使DNA合成受阻[7]。此外，BTG3能夠誘導Smad8蛋白和Smad4蛋白相互結合并進入細胞核，進而參與調控細胞增殖和凋亡。據相關研究報道，BTG3蛋白的C端由于富含脯氨酸的結構域，能夠結合Src蛋白，降低Src酪氨酸激酶活性，導致Ras/MAP激酶信號傳導通路受阻，最終抑制細胞增殖、參與DNA損傷修復以及調節細胞周期[18]。本研究結果表明，胃癌組織中BTG3的表達量較癌旁正常組織低，其原因可能為癌細胞能夠分泌特異蛋白酶降解BTG3蛋白，同時，癌組織中BTG3自身啟動子甲基化導致其表達下調[19]。本研究結果表明，胃癌組織中BTG3表達與TNM分期和脈管癌栓有關，說明BTG3可以參與胃癌發生發展。其機制可能為BTG3能夠阻礙血漿蛋白酶原激活抑制劑1和基質金屬蛋白酶2的表達，進而抑制腫瘤血管形成、細胞增殖以及侵襲。同時，BTG3能夠抑制E2F1表達，進而細胞有絲分裂和分化，而癌組織中BTG3表達下調，使其負性調控作用減弱，促進腫瘤細胞增殖及進展[20]。

本研究結果表明，胃癌組織中miR-106b的表達與BTG3的表達呈負相關。表明miR-106b和BTG3可能均在胃癌形成及進展中發揮重要作用，且miR-106b可能負性調控BTG3，進而影響胃癌進程。既往研究[21]表明，非小細胞癌中miR-106b通過抑制BTG3表達促進腫瘤細胞侵襲及轉移。此外通過miR-106b抑制劑抑制其表達后，BTG3的表達量明顯提高，間接表明miR-106b對BTG3的負性調控作用。然而miR-106b的靶基因眾多，BTG3在胃癌組織中是否為miR-106b的靶點尚不明確，其具體機制有待于進一步深入探究。

綜上所述，胃癌組織中miR-106b表達上調，而BTG3表達下調，二者均與腫瘤TNM分期和脈管癌栓有關，可能成為靶向藥物作用的新靶點。