多柔比星對大鼠心肝腎及免疫器官的長期毒性作用

于靖，裴天仙

1天津市胸科醫院，天津300051；2天津藥物研究院新藥評價有限公司

多柔比星(DOX)又稱阿霉素，是從波賽鏈霉菌變種Streptomyces peucerius var. caesius發酵液中提取的一種蒽環類抗生素，屬于細胞毒類抗腫瘤藥，抗瘤譜較廣，臨床療效高。DOX主要用于急性白血病、乳腺癌、淋巴瘤等的治療[1～3]，一般為二線藥物，可作為惡性淋巴瘤交替使用的首選藥物。DOX雖然廣泛用于治療各種癌癥，但毒性較大，長期使用可發生劑量依賴性的多器官毒性，這使其臨床應用受到限制。目前從臨床檢驗和毒理學角度，對DOX在多個臟器毒性作用的實驗研究較少。2018年6～12月，本研究觀察DOX對大鼠心臟、肝臟、腎臟及免疫器官的長期毒性作用，以期為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級SD大鼠48只，雄性，4～6周齡，體質量140～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號SCXK(京)2012-0001。DOX購自海正輝瑞制藥有限公司，批號H33021980，將DOX用5%葡萄糖注射液充分溶解稀釋至濃度為0.23、0.47、0.93 mg/L；5%葡萄糖注射液購自四川科倫藥業股份有限公司，批號A15033210-1；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)檢測試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)公司。BD FACS AriaⅡ型流式細胞儀專用試劑購自美國BD公司；全自動生化分析儀c701購自德國羅氏診斷有限公司；FACS Aria Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD公司；BX53普通光學顯微鏡、DP71病理顯微攝影系統均購自奧林巴斯公司；梅特勒-托利多PL203電子天平購自廣州滬瑞明實驗儀器有限公司。

1.2 動物分組及給藥 將48只SD大鼠隨機分為溶劑對照組及DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組，每組12只，屏障系統飼養。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組分別給予0.23、0.47、0.93 mg/L DOX經尾靜脈推注，給藥體積30 mL/m2；溶劑對照組給予等體積的5%葡萄糖注射液經尾靜脈推注，均緩慢勻速推注。每3周給藥1次，共給藥4次。給藥結束，用20%烏來糖(4～6 mL/kg)腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血，剖取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾及腸系膜淋巴結以備用。

1.3 血液生化指標檢測 經大鼠腹主動脈取血3～5 mL，置于真空促凝采血管內，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，取上層血清備用，用羅氏全自動生化分析儀檢測ALT、AST、CK、BUN、CRE。

1.4 大鼠外周血淋巴細胞亞群檢測 EDTA抗凝全血100 μL，加入10 μL抗大鼠抗體CD3+-FITC、CD4+-APC、CD8+-PE、CD45RA-PE-Cy5，室溫避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次。采用流式細胞儀參照試劑盒說明書計數CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞，計算CD4+/CD8+，并計數CD45RA+B細胞亞群。

1.5 臟器系數測定 實驗結束后，稱取大鼠體質量，剖取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾和腸系膜淋巴結，用4%甲醛固定，以備組織病理學檢查；剔除心臟、肝臟、腎臟、胸腺和脾臟附著的結締組織和脂肪，精密稱取質量，計算臟器系數，臟器系數=臟器質量/體質量×100%。

1.6 大鼠臟器組織病理變化觀察 取大鼠心臟、肝臟、腎臟、胸腺、脾及腸系膜淋巴結置于4%甲醛固定液中，固定24～48 h，常規脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、透明和封固，于光學顯微鏡下觀察各組織的病理變化[4，5]。

2 結果

2.1 DOX對大鼠血液生化指標的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0 mg/m2組血液生化指標差異無統計學意義(P均>0.05)，DOX 14.0 mg/m2組AST、BUN、CRE高(P均<0.05)，DOX 28.0 mg/m2組ALT、AST、BUN、CRE高(P<0.05)；各組血清CK水平比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 DOX對大鼠血液生化指標的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05

2.2 DOX對大鼠外周血淋巴細胞亞群的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群、CD45RA+B細胞亞群計數低，CD4+/CD8+高，DOX 14.0、28.0 mg/m2組外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群、CD45RA+B細胞亞群計數、CD4+/CD8+與溶劑對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 DOX對大鼠外周血淋巴細胞亞群的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05

2.3 DOX對大鼠臟器系數的影響 與溶劑對照組比較，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組大鼠心臟、肝臟、腎臟的臟器系數均高，胸腺、脾臟臟器系數均低。其中，DOX 14.0 mg/m2組的肝臟、腎臟、胸腺臟器系數及DOX 28.0 mg/m2組的各器官臟器系數與溶劑對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 DOX對大鼠各臟器系數的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05。

2.4 DOX對大鼠各臟器組織的毒性作用 溶劑對照組心臟結構完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質未見異常。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的心臟病變，表現為心肌細胞空泡變性、壞死，部分伴有心耳血栓。溶劑對照組肝細胞索以中央靜脈為中心排列整齊，細胞形態清晰，間質無異常改變。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2組肝組織未見明顯異常，DOX 28.0 mg/m2組可見肝細胞不同程度空泡變性。溶劑對照組腎臟皮髓質結構完整，腎小球、腎小管形態清晰正常，間質未見明顯異常。DOX 7.0 mg/m2組腎臟組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的腎病綜合征表現：腎小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，部分見新月體形成；腎小管變性、壞死、再生、擴張、管型、基膜增厚；間質炎細胞浸潤。溶劑對照組胸腺結構完整，皮髓質分界清晰，皮質內密集分布大量胸腺細胞。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常。而DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的胸腺萎縮，表現為皮質變薄，皮髓質分界不清晰，皮質內胸腺細胞減少乃至缺失。溶劑對照組脾臟由白髓、邊緣區和紅髓組成，結構完整清晰，紅髓包含脾索和血竇。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的脾臟萎縮，表現為白髓淋巴細胞減少，其中邊緣區減少更為明顯。溶劑對照組腸系膜淋巴結見皮髓質結構完整，細胞形態清晰，淋巴小結增生活躍。DOX 7.0 mg/m2組胸腺組織未見明顯異常，DOX 14.0、28.0 mg/m2組可見不同程度的淋巴結萎縮，表現為淋巴細胞減少。

3 討論

DOX屬蒽環類抗腫瘤抗生素，是具有代表性的細胞毒類藥物，在腫瘤內科治療發展歷程中具有里程碑意義，已有50多年的應用歷史。即使在靶向治療、免疫治療等新療法不斷涌現的今天，DOX仍然是很多實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤治療的基礎性藥物[6]。DOX是由微生物產生的具有抗腫瘤活性的化學物質，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用，但S期細胞對其最敏感。DOX可導致多器官毒性，可能的機制包括氧化應激、炎癥、自由基的產生、DNA損傷、鈣超載、細胞凋亡等，但最可能的機制是氧化應激[7，8]。

臟器系數又稱臟體比，是實驗動物某臟器的質量與其體質量之比。正常時成年大鼠各臟器與體質量的比值比較恒定。動物發生毒性病變后，受損臟器質量可能發生改變，故臟器系數也隨之改變。臟器系數增大，表示臟器充血、血栓、空泡變性(水樣變、脂肪變或糖原沉積)、增生、肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。

心臟毒性是蒽環類藥物最為嚴重的不良反應，蒽環類藥物引起心臟毒性的主要機制為鐵介導的活性氧簇的產生及促進心肌的氧化應激[9]。本研究發現，DOX各組心肌細胞變性、壞死，部分血栓形成，同時臟器系數升高，28.0 mg/m2組升高尤為顯著，可見DOX有明顯的心臟毒性，這與相關研究[10]結果一致。但心肌酶譜中CK在各實驗組并未明顯升高，其原因可能因為CK靈敏度較低，如果采用敏感度較高的肌鈣蛋白和反映心肌張力變化的BNP或NT-proBNP來預測心肌細胞損傷，可能會出現不同的結果。因目前實驗室所用試劑盒只能檢測人血清，無法檢測鼠來源血清，因此未對以上指標進行檢測。

DOX主要在肝臟代謝，經膽汁排泄，有少量經腎臟由尿排出，因此其對肝腎功能的損傷也不容忽視。本研究發現，DOX 28.0 mg/m2組肝臟中肝細胞空泡變性，DOX 14.0、28.0 mg/m2組為腎病綜合征，表現為腎小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，腎小管變性、壞死和腎間質炎細胞浸潤；另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2組肝臟和腎臟質量增加，臟器系數升高。可見，DOX有明顯的肝腎毒性，有研究顯示，DOX導致肝腎毒性的機制可能與凋亡、炎癥和氧化應激有關[11]。

正常機體中各T淋巴細胞亞群相互作用，維持著機體的免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，機體就可導致免疫功能紊亂并發生一系列的病理變化。胸腺是中樞免疫器官，內有大量的胸腺細胞，即分化發育的各期T細胞；脾臟和淋巴結是外周免疫器官，組織內的淋巴細胞包括B細胞和T細胞，其中脾臟內淋巴細胞中B細胞約占60%，T細胞約占40%；淋巴結以B細胞為主，T細胞主要分布在邊緣區[12]。本研究結果表明，在外周血中，DOX 14.0、28.0 mg/m2兩個劑量可致大鼠CD3+、CD4+、CD8+T細胞計數和CD45RA+B 細胞計數降低，CD4+/CD8+升高，機體免疫功能紊亂。另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2組胸腺和脾臟較小，臟器系數明顯降低。顯微鏡下發現，DOX 14.0、28.0 mg/m2組胸腺、脾臟、淋巴結發生不同程度的萎縮，表現為T和(或)B細胞減少。由此可見，14.0、28.0 mg/m2的DOX可致大鼠免疫器官萎縮，免疫功能降低。

綜上所述，DOX作為一種臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，其對大鼠心、肝、腎和免疫器官均有不同程度的毒性反應。但本研究只是初步觀察了DOX的毒性作用，未對其致毒的機制進行深入探討，這將是今后工作的方向和重點。