C3G在結直腸癌組織中的表達變化及意義

左忠林，陳鵬，姚暉，胡欣雨，徐亮，夏冬

西南醫科大學附屬第一醫院，四川瀘州646000

美國癌癥學會發布最新全球癌癥統計顯示，至2018年全球結直腸癌新發病例超過110萬、死亡病例達88萬，成為全球發病率第3、死亡率第2的惡性腫瘤[1]。結直腸癌的發生發展大致經歷從正常黏膜、腺瘤、腺癌到遠處轉移多階段復雜過程，包含了多個癌基因的激活、抑癌基因的失活，涉及眾多細胞信號通路的調節。探索新的靶點對結直腸癌早期預防、診斷、治療、監測預后有重要意義。Ras相關蛋白1(Rap1)是Ras癌基因家族中的一種小分子三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白，其參與了細胞黏附、細胞連接功能、侵襲、遷移、外分泌、細胞極性、細胞凋亡和增殖等[2]，Rap1對信號傳遞的調控主要由Rap1鳥苷酸交換因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)催化，GEF可使Rap1蛋白結合GTP引起蛋白構象成為活化狀態(Rap1-GTP)，從而激活下游效應分子；GAP則可水解Rap1-GTP中的GTP并結合GDP，成為失活狀態(Rap1-GDP)。Crk SH3域結合鳥嘌呤核苷酸交換因子(C3G)是第1個被發現的Rap GEF[3]。近年來有研究發現，C3G參與非小細胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發生發展，但在不同腫瘤組織中C3G表達不一，所起效應也不相同。2019年4～9月，本研究探討C3G在結直腸癌組織中的表達變化及意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 收集本院2012年11月～2013年12月手術切除的結直腸癌組織及其癌旁(距腫瘤邊緣>5 cm)正常組織69例份，用于免疫組化法檢測，均經病理檢查確診，患者男33例，女36例，平均年齡56.8歲。收集本院2019年5～8月經手術切除的31例份結直腸癌新鮮組織及配對的31例份癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，用于實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測，均經病理檢查確診。以上入組患者術前均未接受放化療、免疫治療等，并未合并其他系統惡性腫瘤，且臨床及病理資料完整。本研究由西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，標本收集均在患者簽署知情同意書(KY2019103)后進行。

1.2 結直腸癌組織及其癌旁組織中C3G表達檢測 采用免疫組化法。標本經固定后石蠟包埋常規處理，切片經烘干，脫蠟、水化、高壓、高溫抗原修復，去過氧化物酶活性，血清封閉后，每片加入C3G一抗，4 ℃孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗，37 ℃孵育，再次清洗，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，再次沖洗，氨水返藍，流水沖洗，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結果采用雙盲法由2名病理科醫生判定，按染色強度及陽性細胞百分比進行評分[4]，染色強度無色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽性細胞百分比為0計0分、≤10%計1分、11%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4分。將以上兩項評分相乘，4～12為蛋白表達陽性。

1.3 結直腸癌組織中C3G mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術。將TRIzol裂解液分別加入所需組織細胞中，提取總RNA，于65 ℃變性，提取RNA 0.5 μg，于逆轉錄混懸液中37 ℃孵育2 min后得到反轉錄產物cDNA，取cDNA 2 μL配制成PCR體系20 μL(BeyoFast SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物混合液 2 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free Water 6 μL)，反應條件：95 ℃預變性2 min，在95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環后，經過95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s形成熔解曲線。每孔設置3個復孔，重復3次，結果采用2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量，取平均值。C3G上游引物序列5′-CCTTGGATCTGGAGCAGCA-3′，下游引物序列5′-GTCCCTGCTTCTCGATGGT-3′；內參GAPDH上游引物序列5′-CCTTGGATCTGGAGCAGCA-3′，下游引物序列5′-GTCCCTGCTTCTCGATGGT-3′。

1.4 隨訪 采用電話與臨床查閱病歷的方式隨訪，記錄患者生存時間，隨訪日期截至2019年9月2日，其中C3G表達陽性患者失訪5例，陰性患者失訪2例。

2 結果

2.1 C3G在結直腸癌及其癌旁正常組織中的表達比較 C3G蛋白定位于細胞質和細胞膜內，陽性表現為黃色或棕黃色顆粒。在結直腸癌與癌旁組織中，C3G蛋白陽性表達率分別為60.87%(42/69)、34.78%(24/69)，比較差異有統計學意義(χ2=9.409，P<0.05)。結直腸癌組織中C3G mRNA相對表達量是癌旁正常組織的(5.86±2.03)倍，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 結直腸癌組織中C3G蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系 C3G蛋白陽性表達與結直腸癌TNM分期(χ2=7.912，P=0.005)、腫瘤浸潤深度(χ2=4.242，P<0.039)、淋巴結轉移(χ2=14.621，P<0.001)、CEA水平(χ2=12.503，P<0.001)有關，與患者年齡、性別無關(P均>0.05)，見表1。

表1 結直腸癌組織中C3G蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系(例)

2.3 C3G蛋白表達與結直腸癌患者預后的關系 隨訪結果顯示，截至2019年9月2日，C3G蛋白陽性表達42例，死亡25例，存活12例，失訪5例；C3G蛋白陰性表達27例，死亡10例，存活15例，失訪2例。通過Kaplan-Meier生存曲線分析，C3G蛋白陽性表達與陰性表達患者術后5年生存率分別為32.43%(12/37)、60.0%(15/25)，二者比較差異有統計學意義(χ2=4.612，P<0.05)。

3 討論

C3G主要通過接受上游刺激信號，催化Rap1結合GTP并釋放GDP發揮作用，由于是第1個被證明包含Cdc25同源模體的Rap GEF，又被稱為Rap GEF1，相對分子質量為140 kD，在結構上主要由三部分模塊組成：①C-端是GEF催化序列，包括Ras交換結構域和Cdc25同源結構域，負責向下游傳遞信號；②N-端殘基有能與E-鈣黏蛋白作用的序列，能夠負向調控C3G活性；③中間則為脯氨酸富集域，并包含易被不同激酶磷酸化的酪氨酸殘基504，能夠與上游Crk、Hck、Cas、c-Abl等相互作用而被激活[3,5,6]。

C3G于1994年被Tanaka等[3]首次報道，Hirata等[7]率先在非小細胞肺癌中研究后發現，其在癌細胞中表達上調并通過Crk-C3G-Rap1信號通路導致肺癌的發生發展。之后的研究表明，C3G在不同癌組織細胞中表達、效應有所不同。在小鼠胚胎成纖維細胞中[8]，C3G作為一種抑癌基因可阻止多種致癌基因誘導的惡性轉化；宮頸鱗癌中C3G表達減少并促進宮頸癌細胞增殖和侵襲，其原因與上游調控序列頻繁甲基化有關[9]。但在高侵襲乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、神經母細胞瘤[12]、慢性髓系白血病[13]、甲狀腺乳頭狀癌[14]、肝細胞肝癌[15]等組織中發現C3G過表達，影響腫瘤的發生發展過程。

目前有關C3G在結直腸癌組織中表達的相關報道甚少。本研究發現，結直腸癌組織中C3G mRNA表達明顯高于癌旁正常組織。在肝細胞癌的研究中，從癌癥基因組圖譜、正常組織與腫瘤組織中基因表達等不同數據庫中收集分析肝癌患者mRNA信息發現，肝細胞癌組織中C3G mRNA表達較正常人增加，而轉移性肝癌組織中C3G mRNA表達減少[15]；免疫組化染色結果提示，異常高表達的C3G主要定位于細胞質和細胞膜內，癌組織和癌旁組織中C3G蛋白陽性表達率分別為60.87%、34.78%，且C3G蛋白陽性表達與患者年齡、性別無明顯相關性，但與CEA水平、是否發生淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度及TNM分期等密切相關，這與Che等[11]在卵巢癌中的發現一致，說明C3G可能參與腫瘤增殖、侵襲、轉移等過程，并能一定程度反映腫瘤惡性程度。但C3G表達上調是否會影響患者預后目前暫無相關報道，本研究對入組69例結直腸癌患者通過Kaplan-Meier生存曲線分析發現，C3G蛋白陽性表達患者術后5年生存率明顯低于C3G蛋白陰性表達患者。Sequera等[15]在肝癌的研究中也得出了同樣的結論，說明C3G高表達是患者預后不良的因素之一，但是否為影響預后的獨立危險因素后續還將增加入組病例并進行多因素生存分析。

綜上所述，C3G在結直腸癌組織中表達較正常組織上調，且對結直腸癌的發生發展具有一定促進作用。C3G高表達患者生存期明顯短于低表達患者，因而可作為結直腸癌預后的監測指標。