結直腸癌組織中miR-137、Notch1、DLL4表達變化及意義

曹冉華，呼群，張國建

內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特010050

2018年全球結直腸癌(CRC)新發病例110萬，居所有惡性腫瘤第3位；而死亡病例88萬，居所有惡性腫瘤第4位[1]。隨著我國飲食習慣的改變，CRC發病率和病死率逐漸上升，嚴重威脅人們身體健康[2]。因此有必要深入研究其發生發展機制。微小RNA(miR)是長度為18～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，可調控多條細胞信號傳導通路，在慢性炎癥、腫瘤、免疫性疾病等疾病中均發揮重要作用[3，4]。miR-137位于人類染色體1p21.3，在非小細胞肺癌[5]、胰腺癌[6]等腫瘤組織中異常表達，可通過抑制MRGBP、SRC3等基因的表達，發揮腫瘤抑制作用。Notch信號通路進化上較為保守，該通路主要由Notch受體、Notch配體和DNA結合蛋白構成[7]。哺乳動物Notch受體包括Notch1～4四種，Notch配體包括Jagged1、Jagged2、Delta樣配體1(DLL1)、DLL3、DLL4。腫瘤發生發展過程中，常存在Notch信號通路過度活化，從而抑制腫瘤細胞分化、凋亡及促進血管生成等[8]。近年來有研究表明，腫瘤細胞表面Notch1、DLL4表達升高，DLL4-Notch1介導的信號傳導在腫瘤血管生成、浸潤及轉移中發揮重要調控作用[9]。但目前CRC組織中miR-137與Notch1、DLL4表達的關系研究較少。本研究通過觀察CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4的表達，分析各指標表達的相關性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2017年3月本院診治的CRC患者100例，男59例，女41例；年齡26～79(53.6±7.9)歲；腫瘤直徑≤3 cm者62例，>3 cm者38例；直腸癌35例，結腸癌65例；病理分級為高中分化71例，低分化29例；腫瘤分期Ⅰ期27例，Ⅱ期29例，Ⅲ期32例，Ⅳ期12例；淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移78例；遠處轉移15例，無遠處轉移85例。納入標準：均經病理檢查確診為結直腸腺癌；均為初次診治，以往未接受過放化療、免疫治療；臨床資料完整，患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：合并炎性腸病、自身免疫性疾病等；合并其他惡性腫瘤；合并嚴重心肝肺腎等臟器功能不全。研究經本院倫理委員會審核批準通過。術中收集新鮮CRC組織及距腫瘤邊緣>3 cm的正常組織，置于凍存管內液氮罐速凍，轉運至實驗室于-80 ℃冰箱保存。

1.2 CRC組織及癌旁正常組織中miR-137表達檢測 采用熒光定量PCR法。取組織100 mg，用miRNA分離試劑盒(康朗生物有限公司)提取組織中總RNA和miRNA。紫外分光光度法鑒定RNA溶液的濃度及純度合格后，-80 ℃冰箱保存待測。以總RNA為模板，用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒合成cDNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒(新海基因檢測有限公司)說明書進行。miR-137特異性莖環正向引物序列：5′-TATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3′，反向引物序列：5′-AACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′；內參U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：3′-GGAACGCTTCACGAATTTG-5′。miR-137的總反應體系20 μL，熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環，反應結束后PCR液-20 ℃冰箱保存。反應均在實時定量PCR儀(美國ABI公司，ABI7500)上完成，每個樣本重復檢測3次。用相對Ct值法進行數據分析。

1.3 CRC組織及癌旁正常組織中Notch、DLL4蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。制備羊抗人Notch、DLL4多克隆抗體(工作濃度為1∶500)和即用型二抗(工作濃度為1∶2 000)。DAB顯色，蘇木精復染，光鏡觀察。羊抗人Notch、DLL4多克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒均購自北京中杉公司。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。陽性判斷采用二級計分法，即陽性細胞百分比<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；染色程度計分標準：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐色為3分。以上兩項評分相乘結果≥3判定為陽性。應用Image-pro Plus6.0軟件測量陽性染色區域的光密度值，每個標本隨機選取3個視野，取平均值作為目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 CRC組織與癌旁正常組織中miR-137、Notch1及DLL4蛋白表達比較 CRC組織與癌旁正常組織中miR-137相對表達量分別為0.79±0.24、3.61±0.69，CRC組織中miR-137相對表達量低于癌旁正常組織(t=38.601，P=0.000)。CRC組織與癌旁正常組織中Notch1蛋白陽性表達分別為47例(47%)、5例(5%)，CRC組織中Notch1蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=45.842，P=0.000)。CRC組織與癌旁正常組織中DLL4蛋白陽性表達分別為81例(81%)、29例(29%)，CRC組織中DLL4蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=50.731，P=0.000)。

2.2 CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4表達與患者臨床病理特征的關系 CRC組織中miR-137表達與腫瘤分期有關(P<0.05)，與CRC患者其他臨床病理特征無關(P均>0.05)；Notch1、DLL4蛋白陽性表達與腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、組織分化程度無關(P均>0.05)。

表1 CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 CRC組織中miR-137與Notch1、DLL4蛋白表達的相關性 CRC組織中miR-137的相對表達量與Notch1、DLL4蛋白相對表達量均呈負相關(r分別為-0.654、-0.612，P均<0.05)。

3 討論

近年來隨著影像學技術、內鏡技術等診斷技術的發展，基于臨床分期分級等病理學特征對患者進行手術、放化療及分子靶向治療等，延長了患者的生存時間，5年生存率達60%[10]。但由于CRC腫瘤的異質性，相同分期的患者對相同治療方案的反應及預后各不相同，因此有必要深入研究CRC發生發展的分子機制。近年來研究表明，CRC中Notch信號通路的激活在腫瘤發生發展中起至關重要的作用，如在CRC細胞系中上調Notch1基因或其配體DLL4基因的表達后，可促進HES1等轉錄因子的表達，導致上皮間質轉化及干性相關蛋白的表達增加，促進腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移，與CRC患者的不良預后相關[11]。miRNA是具有基因表達調控作用的非編碼RNA調控分子，研究表明，腫瘤組織中miR-137表達降低導致靶基因mRNA的穩定性增加，腫瘤細胞增殖能力增強，而過表達miR-137后促進腫瘤細胞的凋亡[6]。本研究癌組織中miR-137的相對表達量明顯低于癌旁正常組織，與以往研究報道一致[12]。目前其具體機制尚不清楚，可能是miR-137基因啟動子區域的CpG島的甲基化、泛素化等表觀遺傳學修飾后失活，導致miR-137表達降低[13]。本研究CRC組織中miR137的表達與腫瘤分期有關，Ⅲ～Ⅳ期癌組織miR-137表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，表明miR-137參與CRC的發生發展。

本研究CRC組織中Notch1蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，表明癌組織中Notch1蛋白表達增高，與以往研究[14]一致。其機制可能是腫瘤發生時某些miRNA，如miR-34a表達下降，其結合Notch1的mRNA的3′端非編碼區能力下降，導致Notch1蛋白表達升高，進而影響下游基因如纖連蛋白、波形蛋白等，促進腫瘤的惡性進展[15]。此外，Notch1表達與腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關，其原因可能是Notch1的過表達促進下游Twist、Snail等轉錄因子的表達，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，導致腫瘤的浸潤轉移能力增強，腫瘤分期增高[16]。

人類DLL4基因位于15q14，可編碼由685個氨基酸構成的DLL4蛋白，其可表達于血管內皮細胞，亦可表達于腫瘤細胞表面，通過與Notch受體胞外域結合，活化下游信號。本研究癌組織中Notch1的配體DLL4蛋白表達較癌旁組織高，表明DLL4同樣參與CRC的發生發展過程。其表達升高的機制可能與DLL4的表達受miRNA的調控有關。有研究表明,miR-30a能負性調節DLL4 mRNA的表達，腫瘤發生時miR-30a表達下降，DLL4的表達增加，進而促進血管新生及腫瘤轉移[17]。此外，CRC組織中DLL4表達也與腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關，其原因可能是腫瘤組織中DLL4表達通過結合Notch1進而激活Notch信號通路，促進腫瘤的浸潤、淋巴及血行轉移；而在敲除DLL4后，Notch信號通路受到抑制，腫瘤的浸潤及轉移能力下降[18]。

本研究進一步分析CRC組織中miR137與Notch1、DLL4表達的相關性，結果均呈負相關。其機制可能是miR137可結合Notch1、DLL4的mRNA 3′UTR區，改變mRNA穩定性，進而負性調節Notch1、DLL4的表達[19]。

綜上所述，CRC組織中miR137表達下降，而Notch1、DLL4表達增加，三者共同參與CRC的發生發展，有可能成為CRC診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物，但對于三者之間具體作用機制有待進一步研究。