不同癌癥核酸適配體篩選的研究進展

李名一，姜良勇，高 川，劉媛媛

(1.佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154004；2.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

癌癥是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是導致人類死亡的主要原因之一，對人類健康和生命構成極大威脅。近年來，隨著人口老齡化，發病率和死亡率將整體繼續呈上升趨勢，我國癌癥防治面臨嚴峻的形勢[1]。然而癌癥早期的體征和癥狀特異性不明顯，各種腫瘤標志物也較少，難以實現早期診斷，同時癌癥的治療，比如手術切除不徹底、復發率高和轉移率高等是影響癌癥治療效果的主要問題。因此，從分子水平上發展分子靶向藥物及免疫治療藥物，可以大大提高癌癥病人的治療效果。核酸適配體橫空出世，它俗稱“核酸抗體”[2]，區別于相應的蛋白質抗體。這個術語是由于抗體和適配子之間的相似性而產生的，它可以是單鏈 DNA，也可以是RNA，由于其良好的選擇性，還有對靶標的高親和力，適配子作為分子探針在確保食品安全、環境監測、疾病診斷和治療等方面具有相當大的潛力。它具有與單克隆抗體相匹敵的蛋白質靶標的親和力和特異性。此外，適配子與抗體相比有一定的優勢，因為它們可以化學合成，并且可以引入修飾來提高它們的穩定性和藥代動力學特性。一些針對治療重要靶點的適配子已經在細胞和動物模型中顯示出有效性，少數適配子現在正在進行臨床試驗或正被用作藥物。因此適配子作為一類用于疾病診斷和治療的新型分子探針引起了人們的極大關注，因此我們研究各種癌癥的核酸適配體來用于疾病的治療。

1 與乳腺癌相關的核酸適配體

乳腺癌是女性最常見的癌癥，它是女性中最常見的癌癥，它是當今女性癌癥死亡的第二大原因，僅次于肺癌。乳腺癌的有效和成功治療的關鍵是及時的診斷。鑒于癌癥的復雜性和多樣性，為了提高靈敏度和選擇性，有學者利用酵母和哺乳動物雙雜交系統從隨機組合表達文庫中分離得到了一個新的肽適配子Id1/3-PA7，它能與Id1和Id3特異地相互作用。從而抑制Id1和Id3對E47蛋白的截留，激活E-box啟動子，上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN1A和CDKN1B)的表達，所以說肽適配子Id1/3-PA7能夠誘導乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231細胞周期阻滯和凋亡。它可能是一種無毒的外源性藥物，可顯著刺激乳腺癌細胞的抗增殖和凋亡效應，這與Id1和ID3的表達失控有關。ID蛋白的過度表達，常見于包括乳腺癌在內的幾種人類惡性腫瘤中。它的過度表達及其在腫瘤發生、腫瘤侵襲、轉移和新血管生成中的作用使其成為抗癌治療的有吸引力的靶點，此研究將可能是治療乳腺癌和其他癌癥的一種新策略。

雌激素受體(ER)約在 70%的乳腺癌患者中會出現高表達，從而導致預后不良。這是因為 ER 的高表達增加細胞分裂引起突變，破壞細胞周期，最終導致腫瘤的發生。雌激素反應元件(ERE)，它是雌二醇靶基因啟動子中的一段 DNA短序列，與雌激素-ER 復合物有高親和力。何煦，陳杰等人采用指數富集的配體系統進化技(SELEX)從 ERE 寡核苷酸池中篩選出一段與乳腺癌細胞株 MCF-7(表達ER)作為 ER 核酸適配體[3]，通過體外實驗證明，它能夠抑制體外乳腺癌細胞的增殖。目前治療乳腺癌輔助藥物有很多，但是有很多結果顯示這些藥物長期使用會導致耐藥。通過核酸適配體抑制乳腺癌細胞增殖，進而成為乳腺癌患者的一種治療手段。 而且它對人正常乳腺上皮細胞沒有任何毒副作用。

2 與肺癌相關的核酸適配體

肺癌是位于惡性腫瘤死亡之榜首，對人類的身體健康產生了很多的威脅。肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌，肺癌是中國近年來癌癥死亡的首要原因[4]。大約有80%的肺癌患者被診斷為非小細胞肺癌(NSCLC)，其中化療仍然是非小細胞肺癌的主要治療手段。

肺癌干細胞(CSCs)影響非小細胞肺癌的預后，所以消除肺CSCs可以提高藥物對肺癌的治療效果，CD133抗原是實體腫瘤(包括肺癌)中可能的CSCs標記物，Jun 等人制備一種新型的CD133適配子修飾的DTX脂質體系統，并對其體內外特性進行研究，發現CD133-DTX LP的DTX釋放相對較慢，這是因為CD133適配子的存在可能會阻礙藥物的釋放。在此研究中，研究表明CD133適配子修飾DTX LP可顯著抑制細胞增殖，提高治療效果，體內顯像結果也表明CD133-DTX LP具有很好的腫瘤靶向性。此研究中研究者可以發現核酸適配體在肺癌治療中起著很重要的作用。

半乳糖凝集素-1(Gal-1)是一種β-半乳糖苷結合蛋白，參與腫瘤的發生發展過程。它能夠參與腫瘤免疫逃逸，誘導細胞凋亡，Yao-T等人證明一種新型的Gal-1靶向DNA適配子AP-74M-545，其與Gal-1高親和力結合。通過實驗表明，Gal-1適配子通過阻斷Gal-1和CD45之間的相互作用而抑制腫瘤生長，從而從凋亡中拯救T細胞，恢復T細胞介導的免疫。這些結果表明AP-74M-545可能是一種潛在的腫瘤免疫治療策略。因此研究出具有高特異性適配體是腫瘤治療的關鍵。

3 與肝癌相關的核酸適配體

肝癌是目前世界上第三大致命癌癥，世界上半數以上肝細胞癌發生在我國，中青年居多。肝癌發病機制復雜，發病快，然而沒有比較有效的治療方法。最主要問題是，大多數癌癥都是在晚期診斷出來的，手術切除已經不可行了。 肝癌篩查方法主要依賴于測量血清R-胎兒蛋白(AFP)的水平，這是一種生物標志物，以及超聲成像。AFP的敏感度和特異度非常有限。此外，在癌癥發展的早期階段，即治療最有效的階段，甲胎蛋白并不總是升高，有30%左右肝癌患者的 AFP水平并不升高，最新肝癌診治指南已經不再強調聯合 AFP 檢測的重要性，而且影像學只能提供有限的形態學信息。因此要達到早期診斷的目的，必須有分子探針能夠識別的癌癥特異性生物標志物[5]。

Di等人應用了一種新開發的細胞-SELEX(指數富集配體的系統進化)方法來產生特異性識別肝癌細胞的分子探針，在識別適配子的過程中，使用了兩個肝癌細胞系：肝癌細胞系BNL 1ME A.7R.1(Mear)和非腫瘤細胞系BNL C1.2(BNL)。兩種細胞系均來源于Balb/CJ小鼠。BNL細胞系是來自同一只小鼠的成對細胞系，這兩個細胞系有不同的生物學表型，一個是癌細胞系，另一個不是，其中BNL作為對照組。鑒定出來一組適體，識別出特定的癌細胞特異性適配子，那就是TLS9a和TLS11a，它們能夠特異性地識別Kd在納摩爾范圍內的癌細胞系Mear，最終還評估了這兩種適配子治療人肝癌的可能性。事實上通過選定的適體可以去探索疾病的分子本質，從而獲得更多的信息，也為疾病的治療也提供了幫助。

丙型肝炎病毒感染是一個世界性的健康問題，可導致慢性肝炎、肝硬化和原發性肝癌。病毒NS3絲氨酸蛋白酶除了在病毒多蛋白加工中發揮作用外，還參與與多種細胞之間的相互作用，還會導致惡性轉化。目前NS3被認為是抗病毒藥物的主要靶點。為了抑制NS3蛋白酶活性作為抑制HCV復制的手段，Meital等人采用了一種新的細菌遺傳篩選方法來分離NS3抑制肽適配子進行研究，結論顯示肽適配子在體外對NS3蛋白酶活性有抑制作用，IC50在低微摩爾范圍內，它有望成為干擾HCV生命周期和致病性的一種很有前途的抗病毒方法。

4 與前列腺癌相關的核酸適配體

前列腺癌是指發生在前列腺的一種上皮性惡性腫瘤。前列腺癌的診斷主要依靠直腸指診、前列腺腫瘤細胞表面抗原PSA、經直腸前列腺超聲和盆腔MRI檢查，PSMA被認為是一種很好的前列腺腫瘤細胞標志物。血清PSA測定高于4.0 ng/mL的臨界值通常被認為是陽性的，PSMA的表達主要是前列腺特異的，在大腦、唾液腺和小腸中的表達水平非常低。但是由于PSA靈敏度有限，因此為了做到更加準確的診斷，我們探索并創建核酸酶穩定的RNA適配子來結合和抑制前列腺腫瘤細胞表面抗原PSMA的酶活性。 Shawn E.等人研究鑒定出來兩個人工合成的寡核苷酸(適配子)，它們被分別命名為xPSM-A9和xPSM-A10[6]，它們是從最初的40mer文庫中挑選出來的，該文庫由61014個隨機序列RNA分子組成，目的是為了它們能夠與代表PSMA胞外706個氨基酸的重組蛋白(稱為xPSM)結合，這些適配子的高親和力通過它們抑制PSMANAALADase活性的能力來證明，相信在未來會有更多的PSMA適配子用來進一步研究，來評估它們作為前列腺癌診斷和治療藥物的前景。

5 展望

核酸適配體的優勢在于其廣闊的前景和諸多優點，如適配體的特異性、選擇性，能夠識別目標癌細胞，減少對正常細胞的損傷。其缺乏免疫原性，可降低免疫反應。許多適配子(如IgE，IFN-g)亦可作為治療靶點[7]。而且它們足夠大，可以與生物聚合物靶標緊密而特異地結合，與傳統藥物相比，似乎更難對它們產生抗藥性。但是仍然還有許多問題需要解決：①它用SELEX篩選耗費時間長，目前被篩選出來的核酸適配體仍然非常少，所以需要研究出更多種類的核酸適配體；②它與靶點的結合，限制了檢測的靈敏(1)通過體外SELEX方法選擇的核酸適配體可能無法在體內穿過屏障，也無法有效識別體內特定的腫瘤蛋白質，會使治療效果不好。解決辦法就是將實驗動物作為靶標，這樣得到的核酸適配體會具有更好的靶向特異性及穩定性[8]。(2)核酸適配體的治療性化合物是針對一種單一的耐藥機制，難以完全克服腫瘤的多藥耐藥性腫瘤性。改進方法是對給藥系統進行不斷完善。(4)如一些限制核酸適配體技術，因為它的獨家專利也影響著核酸適配體的發展。目前核酸適配體還不及抗體應用范圍廣，其仍在不斷的研究中，因此進一步在各種腫瘤疾病中對核酸適配體進行更廣泛的研究，需要業內專家不斷的努力。相信隨著相關技術的不斷進步，越來越多不同的核酸適配體將被篩選出來，這對疾病的早期診斷與治療具有重要意義。