維生素D3治療糖尿病腎病患者的療效及腎組織足細胞損傷與ROS、AOPP、SOD的相關性分析

趙曄，于磊，王秀穎，董麗娜

糖尿病腎病(DN)是臨床較為常見的糖尿病微血管并發癥，主要以彌漫性腎小球硬化、大量蛋白尿及尿清蛋白排泄率(UAER)水平升高為臨床表現[1]。而隨著DN病情的不斷發展，尿蛋白排泄及腎小球破壞逐漸加重，最終造成腎間質、腎小管及腎小球纖維化，是導致終末期腎病的重要影響因素[2]。范廷廷等[3]研究顯示，在DN發病時，機體足細胞顯著減少，且程度與蛋白尿量呈正相關，足細胞數量降低，加速了終末期腎衰竭患者的衰竭速度。研究顯示，威廉姆斯腫瘤蛋白-1(WT-1)是一種主要在細胞核上表達的足細胞核蛋白；synaptopodin是主要在足細胞細胞膜上表達的特異性骨架蛋白，其表達情況可以間接反映腎組織足細胞損傷的程度[4]。另外足細胞裂孔膜蛋白(Nephrin)是一種跨膜蛋白，存在于足細胞裂孔隔膜上，在腎小球濾過功能中起著重要的作用；而足細胞標志蛋白(PCX)是足細胞損傷的標志性物質，正常情況下2種物質不在尿液中出現[5]。多項研究顯示，腎臟對機體氧化應激反應較為敏感，在DN的發生發展過程中作用顯著[6]。并發DN時，機體會生成更多的血清活性氧(ROS)，從而對足細胞的凋亡起到介導作用，造成PCX的脫落。Hu等[7]認為氧化應激狀態對Nephrin的表達產生一定程度的影響，造成尿蛋白排泄、足細胞脫落及腎損傷的加重。故本研究分析維生素D3治療的DN患者腎組織足細胞損傷與ROS、晚期蛋白氧化產物(AOPP)及超氧化物歧化酶(SOD)的相關性，為其臨床診治提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—2019年1月內蒙古自治區人民醫院腎內科診治DN患者86例作為研究對象，根據患者UAER分為大量組(UAER≥200 μg/min，n=46)和微量組(20 μg/min≤UAER<200 μg/min，n=40)2組。2組患者在性別、年齡、糖尿病病史、BMI、血壓、血糖及合并癥等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)診斷標準： ①患者空腹血糖(8 h內未進任何食物，飲水除外)>7.0 mmol/L；②伴有典型的高血糖及高血糖危象癥狀者，隨機血糖>11.0 mmol/L；③2 h糖耐量試驗血糖>11.0 mmol/L；④糖化血紅蛋白含量>6.5%者；⑤可伴有不同程度的腎功能不全；⑥排除其他相關原因引起的持續性及間歇性臨床蛋白尿；⑦伴有視網膜病變者；⑧腎活檢確診[8]。(2)納入標準：①符合上述DN診斷標準者；②臨床資料完整者。(3)排除標準：①合并急性、慢性炎性反應者；②妊娠、哺乳期患者；③合并其他繼發性或原發性腎病者；④合并嚴重精神疾病、心腦血管疾病及肝臟疾病者；⑤對維生素D3過敏者；⑥6個月內應用抗氧化劑、血管緊張素受體拮抗劑等藥物者；⑦依從性差，中途退出者。

1.3 治療方法 所有患者均給予高血壓和糖尿病飲食教育，治療期間使用胰島素維持血糖在正常水平。對于高血壓患者給予適量的ARB或ACEI類藥物控制血壓。患者于6周洗脫期后，以骨化三醇(青島正大海爾制藥有限公司生產)0.25 μg/d口服，治療3個月。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 血清ROS、AOPP及SOD水平測定：于治療前后清晨空腹抽取患者肘靜脈血2 ml，離心取上清，采用比色法測定血清ROS、AOPP及SOD水平。

1.4.2 尿PCX、Nephrin水平測定：收集患者治療前、治療3個月后晨尿10 ml，采用酶聯免疫吸附法測定PCX、Nephrin，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，操作方法嚴格按照說明書執行。

表1 2組患者基線資料比較

1.4.3 腎臟組織內synaptopodin和WT-1表達測定：采用10%甲醛對腎臟穿刺活檢腎組織進行固定，石蠟切片，抗原采用95℃微波修復10 min。以小牛血清在室溫下封閉20 min;再向其中加入小鼠抗人synaptopodin單克隆抗體(上海酶聯生物科技有限公司)，在4℃條件下孵育12 h;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次。兔抗小鼠IgG經異硫氰酸熒光素[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]進行標記，在室溫條件下孵育20 min;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次;再向其中加入兔抗人WT-1多克隆抗體(北京義翹神州生物技術有限公司)，在4℃條件下孵育12 h;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次。羊抗兔IgG采用羅丹明[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]標記，在室溫條件下孵育20 min。采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次，封片。采用激光共聚焦熒光顯微鏡(EVOS型, 賽默飛世爾公司)雙熒光集成圖像對synaptopodin和WT-1染色分布情況進行觀察,并采用Imagerpro5.0圖像分析軟件對synaptopodin和WT-1陽性百分比進行計算。

2 結 果

2.1 2組血清ROS、AOPP及SOD水平變化 與治療前比較，治療3個月后2組患者血清ROS、AOPP水平均明顯降低，血清SOD明顯升高；與大量組比較，治療后微量組上述指標變化更為顯著(P<0.01)，見表2。

2.2 2組尿PCX及Nephrin水平變化 與治療前比較，治療3個月后2組患者尿PCX及Nephrin水平均明顯降低；與大量組比較，治療后微量組患者上述指標降低更為顯著(P<0.01)，見表3。

2.3 2組腎臟組織內synaptopodin和WT-1表達水平比較 與治療前比較，治療3個月后2組患者腎臟組織內synaptopodin和WT-1表達水平均明顯降低；與大量組比較，治療后微量組患者上述指標降低更為顯著(P<0.01)，見表4。

2.4 尿PCX、Nephrin與血清ROS、AOPP、SOD水平相關性分析 經Pearson相關性分析，患者尿PCX、Nephrin水平與血清ROS、AOPP呈正相關，與血清SOD呈負相關(P<0.05)，見表5。

表3 2組患者治療前后尿PCX及Nephrin水平變化

表4 2組患者治療前后腎臟組織內synaptopodin和WT-1表達水平比較

表5 尿PCX、Nephrin水平與血清ROS、AOPP及SOD水平的相關性分析

表2 2組患者治療前后血清ROS、AOPP、SOD水平變化

2.5 腎臟組織內synaptopodin和WT-1與血清ROS、AOPP、SOD水平相關性分析 經Pearson相關性分析，患者synaptopodin和WT-1表達水平與血清ROS、AOPP呈正相關，與血清SOD呈負相關(P<0.05)，見表6。

表6 synaptopodin和WT-1表達水平與血清ROS、AOPP及SOD水平的相關性分析

3 討 論

足細胞是一種終末分化的，位于腎小球臟層的上皮細胞，呈現多突狀，是腎小球濾膜的重要組成部分，經分化成熟后，一般不可再生[9]。DN患者在早期發生足細胞損傷時，主要以足突融合、細胞變性肥大、足細胞密度和數量的減少為主要臨床表現[10]。另外，足細胞損傷還會造成機體產生大量的蛋白尿，Nephrin是一種在足細胞裂孔膜上特異性表達的蛋白質，在腎小球機械和電荷屏障功能中發揮重要的作用，其異常表達可以一定程度反映腎臟足細胞損傷情況[11]。Zhang等[12]研究顯示，早期DN患者出現Nephrin表達量代償性增加，從而引起其膜上的骨架蛋白發生重新分布，進而引起骨架上的Nephrin蛋白逐漸脫離出來，隨尿液逐漸向體外排出；另外，此時患者的腎小球屏障也遭到一定程度的破壞，形成蛋白尿。PCX是一種表達于足細胞的唾液酸黏蛋白分子，并存在于細胞頂膜位置，帶負電，參與腎小球分子屏障和電荷屏障的形成[13]。Fan等[14]認為對于足細胞損傷，PCX蛋白表達情況可作為一種標志物。骨化三醇除具有鈣磷代謝調節作用外，還可對RAS系統、活化免疫細胞增殖和細胞外基質沉淀起到抑制作用，改善機體應激狀態，從而起到保護腎臟的作用[15]。本研究顯示，對于大量和微量蛋白尿患者，骨化三醇均可減少尿PCX、Nephrin 及synaptopodin、WT-1的生成，改善機體應激反應。Zhu等[16]研究認為，高糖環境下對腎小球足細胞進行培養，可增加Col-Ⅳ蛋白、纖維連接蛋白的分泌，加入維生素D3后會緩解上述癥狀，改善足細胞損傷。Yang等[17]研究認為維生素D3可以抑制腎素形成、下調RAS，從而對系膜細胞增殖情況產生抑制效果，進而改善足細胞損傷。

綜上所述，維生素D3可以一定程度改善DN患者足細胞損傷及氧化應激狀態，且DN患者足細胞損傷與血清ROS、AOPP水平呈正相關，與血清SOD水平呈負相關，具有一定的臨床應用價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙曄：整理資料，分析資料，撰寫論文；于磊：修改總指導；王秀穎：收集整理資料，分析數據，圖表設計；董麗娜：查找參考書籍，收集資料