UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用鑒別摻假蜂蜜

謝 博1,2,3,傅 紅2,3,楊 方

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,福建福州 350001; 2.福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108; 3.福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室,福建福州 350108)

蜂蜜富含豐富的礦物質、維生素、單糖、酶、氨基酸及其他酸類物質,具有抗菌消炎、抗氧化等多種生物活性,是天然的保健食品,也因此受到廣大消費者的青睞[1-2]。然而,我國的很多蜂農和廠家受經濟利益的驅使,向蜂蜜中添加外源糖漿、將低等蜂蜜摻入高等蜂蜜中以次充好,使得蜂蜜品質參差不齊,嚴重阻礙了蜂蜜市場的監管與管理[3]。

目前對于摻假蜂蜜的檢測主要集中在糖類物質的研究。可根據摻入蜂蜜中糖漿的不同采取不同的檢測方法,采用液相色譜-同位素比值質譜法、傅里葉變換近紅外光譜分析法、拉曼光譜、熒光光譜、核磁共振、高效液相串聯質譜法、薄層色譜法(TLC)等方法檢測蜂蜜中C-3、C-4糖的含量,或是研究蜂蜜中C-3/C-4的比值[4-10]。但這些方法有的特異性高,一種方法只能檢測摻入一種糖漿的蜂蜜,具有一定的局限性;有的方法操作復雜,耗時長,成本大,靈敏度低。除了以糖作為檢測物質判定蜂蜜真假之外,因蜂蜜中含有約0.1%～0.5%的蛋白類物質,以蛋白類物質作為標準物檢測蜂蜜真偽也成為學者們研究的新方向[11]。蜂蜜中加入糖漿或不同蜜源蜂蜜的混合會使原蜂蜜的蛋白豐度降低,或者原蜂蜜中可能存在外源性蜜源蛋白。Zhang等[12]基于兩種抗蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)的特異性多克隆抗體(POAB),研制了一種快速金夾心免疫層析條(GSIS),該方法可快速檢測蜂蜜摻假。鄧建軍等[13]對不同蜂蜜進行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析發現,摻假蜂蜜蛋白質含量明顯低于真蜂蜜。蜂蜜中氨基酸的種類和含量與其來源密切相關,根據氨基酸的差異不僅可以區分蜂蜜的來源,還可衡量蜂蜜是否摻假[14]。Iglesias等[15]和Nisbet等[16]發現蜂蜜中脯氨酸含量≥180 mg/kg,且已將脯氨酸含量用作評價蜂蜜成熟度和蜂蜜摻假的標準。

多肽的特異性強,通過多肽定位的蛋白質可直接反映源物質的特點,因此從多肽的角度出發研究摻假食品已成為當今學者關注的熱點。周廣運等[17]采用超高效液相色譜-串聯質譜法鑒定出了5種豬肉中存在的特異性多肽,可用于肉品摻假的鑒定。陽洪波等[18]采用液相色譜-質譜技術篩選出了3種豬源性膠原蛋白特征肽段,4種牛源性膠原蛋白特征肽段,1種羊源性膠原蛋白特征肽段,可用作膠原蛋白的鑒定。房芳等[19]采用鳥槍蛋白組學技術發現了可以鑒別阿膠及其他物種膠原蛋白的特異性肽段。但采用高效液相色譜-質譜聯用技術鑒定摻假蜂蜜的報道較少。

本研究以UPLC-Q-Exactive聯用的方法對2種摻假蜂蜜,4種未摻假蜂蜜胰蛋白酶酶解之后的肽段進行分析,通過檢索Uniprot蛋白數據庫得出多肽的序列及來源,對比摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜多肽的區別,并篩選4種未摻假蜂蜜中共有而摻假蜂蜜中未檢測到的肽段,為以蛋白類物質為基礎研究蜂蜜摻假提供依據與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4種未摻假蜂蜜分別為棗花蜜、槐花蜜、金銀花蜜、椴樹蜜 均購自北京中蜜科技發展有限公司;2種摻假蜂蜜分別編號為1530和6344 經福建省出入境檢驗檢疫技術中心同位素質譜鑒定,C-4糖含量分別為36.5%(1530)、68%(6344),C-4糖含量大于7%即視為摻假蜂蜜;三氯乙酸、碳酸氫銨為分析純 購自國藥集團產品;Tris 生工生物工程股份有限公司產品;二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(IAA)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propanesulfonate,CHAPS) 美國Bio-Rad公司;胰蛋白酶 質譜測序級,乙腈、甲酸、甲醇 色譜純,Thermo Fisher公司;C18固相萃取柱(3 mL,500 mg) 美國Supelco公司。

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜 美國Dionex公司產品;四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀(Q-Exactive) 美國Thermo Fisher Scientific公司產品;UV-2700紫外-可見分光度計 日本島津儀器有限公司產品;CR21N臺式冷凍離心機 日立公司產品;FreeZone?TriadTM2.5 L冷凍干燥機 美國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜蛋白提取 稱取蜂蜜約5 g溶于20%三氯乙酸(TCA)水溶液中,置于-20 ℃冰箱沉淀30 min。將溶液在4 ℃以5000 r/min離心10 min,棄去上清液。10 mL超純水洗滌沉淀,再次離心。重復洗滌步驟,將最終的沉淀物溶解在2 mL超純水中,冷凍后凍干[20]。

1.2.2 蜂蜜蛋白的紫外光譜掃描 用蒸餾水配制1 mg/mL蛋白質提取物溶液,取1 mL加入5 mL考馬斯亮藍,考馬斯亮藍與蛋白質形成蛋白質-染料復合物。溫育2 min后,用紫外光譜儀進行全波長掃描[21]。

1.2.3 胰蛋白酶酶解 稱取20 μg胰蛋白酶,加入20 μL 50 mmol/L乙酸溶解,配制成1 mg/mL溶液,用100 mmol/L Tris稀釋至0.01 mg/mL。凍干蛋白質用 100 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液(pH=7.4,含8 mol/L尿素)復溶,取質量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液0.1 mL,加入DTT使其終濃度為20 mmol/L,于60 ℃水浴1 h后加入IAA使其終濃度為40 mmol/L,室溫避光放置30 min后加入100 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液使尿素終濃度≤1 mol/L,加入100 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃酶解20～24 h。沸水浴10 min滅酶活,10000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液備用[17]。

1.2.4 凈化 C18SPE柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取1.2.3中得到的上清液3 mL過柱,用3 mL甲醇洗脫,重復3～4次,收集洗脫液。45 ℃氮吹至近干,用1 mL的0.1%甲酸水溶液溶解,過0.45 μm濾膜,待測。

1.2.5 測定條件

1.2.5.1 色譜條件 Hypersil GOLD UPLC C18色譜柱,1.9 μm×100 mm×2.1 mm;柱溫:30 ℃;流動相:A:0.1%甲酸水,B:乙腈,梯度洗脫程序:0～50 min(10%～90% B),50～55 min(90% B),55～56 min(90%～10% B),56～60 min(10% B);流速:0.2 mL/min;進樣量:10 μL。

1.2.5.2 質譜條件 掃描模式：Full MS/dd-MS2，分析時長60 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：100～1500 m/z，一級質譜分辨率:70000，AGC目標：le6，一級最大離子注入時間：100 ms，掃描范圍數量：1，動態排除：40.0 s一次，MS2激活類型：HCD，質荷比窗口寬度：0.4 m/z，二級質譜分辨率：17500，微掃描次數：1，二級最大離子注入時間：50 ms，碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

電噴霧離子源(ESI);載氣為高純氮氣(純度>99.5%),鞘氣流速40個單位(arb),輔氣流速15個單位(arb),吹掃氣流速0個單位;噴霧電壓3.2 kV;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%;毛細管溫度320 ℃,離子透鏡電壓頻率(S-lens RF level)為60,輔氣熱源溫度350 ℃。

1.3 數據處理

采用MaxQuant(版1.6.1.0)進行數據分析。搜索是針對來自蛋白質數據庫Uniport的蜂蜜(uniprot-apis.fasta)的67051種蛋白質序列(2018年4月17日下載,https://www.uniprot.org/)。具體搜索參數為:蛋白假陽性率FDR設置為0.01;最小氨基酸長度設置為3;可變修飾設為N端乙酰化(N-Acetyl)、甲硫氨酸殘基氧化(Oxidation(M));半胱氨酸固定化修飾設置為氨基甲酰化(Carbamidomethyl(C));酶為胰蛋白酶,最大裂解丟失設置為2,所有常見的污染物和相反的命中被刪除[22]。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜蛋白紫外光譜掃描結果

以4種未摻假蜂蜜中的椴樹蜂蜜為例,2種摻假蜂蜜1530和6344以考馬斯亮藍G-250溶液進行染色后,在500～650 nm處進行全波長掃描,所得結果如圖1所示。考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色,最大吸收在488 nm,當與蛋白質結合后呈青藍色,所形成的結合物在595 nm有最大吸收。從圖1可以看出椴樹蜂蜜在595 nm處有最大吸收,說明采用三氯乙酸沉淀法可以有效提取出椴樹蜂蜜蛋白。而1530和6344在595 nm處曲線呈扁平狀,吸收峰不明顯,說明1530和6344蜂蜜中蛋白含量相對較少,這可能是因為摻入外源糖漿使原蜂蜜蛋白濃度減少。通過蜂蜜蛋白含量可區分蜂蜜來源及品質,Chen等[23]根據蜂蜜蛋白質含量區分中國臺灣蜂蜜和泰國龍眼蜂蜜。Dong等[7]選取了35個不能從中提取蛋白質的蜂蜜,通過同位素鑒定為C-4糖或C-3糖摻假。由此可見,蜂蜜中能否提出蛋白質,提出蛋白質含量的多少可間接反映蜂蜜的品質及其是否摻假。

圖1 真偽蜂蜜蛋白光譜掃描Fig.1 Spectral scanning of true and false honey protein

2.2 蜂蜜蛋白酶解結果

4種蜂蜜和2種摻假蜂蜜經1.2.1方法提取蜂蜜蛋白后,胰蛋白酶酶解,UPLC-Q-Exactive分析后的基峰色譜圖如圖2所示,峰的強度均在109,說明樣品濃度較好,其中椴樹蜜、槐花蜜、金銀花蜜、棗花蜜的基峰色譜圖表現出一定的相似性,6344和1530蜂蜜的基峰色譜圖表現出一定的相似性,摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜兩組峰形相差較大。LC-MS/MS鑒定所得數據在Maxquant軟件上進行分析,Maxquant軟件可根據所得質譜圖與蛋白數據庫中的蛋白質序列進行比對,并給出分數,分數越高,Unique peptides越多,所得肽段越可信。肽段在蛋白質數據庫Uniprot上進行Blast,可得多肽來源信息,去除評分較低及其他污染物的多肽,所得結果見表1～表6。

棗花蜜(表1)共鑒定出30條肽段,其中11條是蜂王漿主要蛋白(MRJPs)中MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4酶解的肽段,9條來自于未標記蛋白(Uncharacterized protein),其余10種是蜜蜂中的細菌(Bartonellaapis、Lactobacilluskunkeei、AscosphaeraapisARSEF 7405)中的酶及蛋白質酶解產生的肽段。

槐花蜜(表2)共鑒定到17條多肽,其中4條來自于蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)和蜂王漿主要蛋白3(MRJP3),其他多肽來自于蜜蜂中存在的酶及未標記蛋白。

金銀花蜜(表3)共鑒定出15條多肽,其中1條來自于蜂王漿主要蛋白1(MRJP1),7條來自于意大利蜜蜂中存在的未標記蛋白(Uncharacterized protein),剩余的7條多肽來自于蜜蜂中存在的酶以及受體蛋白等。

圖2 4種蜂蜜與2種摻假蜂蜜酶解產物的LC-MS/MS總離子流圖(TIC)Fig.2 LC-MS/MS total ion flow charts(TIC)of four honeys and two adulterated honey hydrolysates注：從上向下依次是椴樹蜜、槐花蜜、金銀花蜜、棗花蜜、6344、1530。

表1 棗花蜜酶解肽段序列Table 1 Sequences of enzymatic hydrolysis peptides in jujube honey

表2 槐花蜜酶解肽段序列Table 2 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of Sophora japonica honey

表3 金銀花蜜酶解肽段序列Table 3 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of honeysuckle honey

椴樹蜜(表4)共鑒定出18條多肽,其中4條來自于蜂王漿主要蛋白(MRJPs),2條來自于葡萄糖苷酶(Alpha-glucosidase),7條來自于未標記蛋白,1條來自于葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase),葡萄糖氧化酶可以將葡萄糖轉化為葡萄糖酸內酯,然后水解成葡萄糖酸,且其產生的過氧化氫具有殺菌作用[15]。

6344蜂蜜(表5)共鑒定出3條多肽,主要來源于蜂蜜中細菌體內存在的蛋白,如Bartonellaapis(蜜蜂巴爾通體菌)的鉬蛋白鉬轉移酶、AscosphaeraapisARSEF 7405(蜜蜂球囊菌ARSEF 7405)姐妹染色單體內聚因子等。

1530蜂蜜(表6)共鑒定出5條多肽,主要來自于意大利蜂蜜的未標記蛋白、TATA-結合蛋白相關因子、含PDZ結構域蛋白等。兩種蜂蜜均未鑒定出來自于蜂王漿主要蛋白的多肽。

表4 椴樹蜂蜜酶解肽段序列Table 4 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of tilia honey

表5 6344酶解肽段序列Table 5 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 6344

表6 1530酶解肽段序列Table 6 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 1530

表7 6種蜂蜜多肽生物來源分析Table 7 Biological sources of 6 honey peptides

注:蜜蜂指Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera。

2.3 多肽來源分析

從多肽的生物來源分析4種未摻假蜂蜜和2種摻假蜂蜜可以看出(表7),棗花蜜、槐花蜜、金銀花蜜、椴樹蜜有80%的多肽來自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),其余20%主要來自蜂蜜中存在的一些細菌,四種未摻假蜂蜜均存在唯一肽段(Unique peptide)大于2的蛋白酶解產生的肽段,而摻假蜂蜜1530中雖然檢測到了來自蜜蜂Apisceranacerana的多肽,但其對應的蛋白的唯一肽段(Unique peptide)為1,可信度不高。摻假較為嚴重的摻假蜂蜜6344(C-4含量為68%)中未檢測到來自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera)的多肽。

從多肽的蛋白來源分析,4種未摻假蜂蜜中均不同程度的鑒定到來自MRJPs的多肽,而2種摻假蜂蜜均未檢測出來自MRJPs的多肽。其中,蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)是大量存在于蜂蜜中的蛋白[1]。4種未摻假蜂蜜均檢測到了來自MRJP1的肽段,但摻假蜂蜜未檢測出。其他學者也有類似的發現,Bilikova等[24]便以MRJP1為抗原制備抗體,采用酶聯免疫吸附的方法快速檢測摻假蜂蜜,并具有較好的準確性。Won等[25]采用MALDI-TOF鑒定出不同蜜蜂所產的MRJP1存在一定的差異,可以有效區分不同蜂蜜品種,摻假蜂蜜因摻入了外源糖漿和蜂蜜,蛋白質種類及含量會有所變化,通過區分摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的MRJP1同樣可以鑒定摻假蜂蜜。由此可見,MRJP1或可能作為鑒定摻假蜂蜜的潛在標志物。

表8 肽段EYILVLSNK Maxquant分析結果Table 8 Analysis results of peptide EYILVLSNK by Maxquant

圖3 MRJP1氨基酸排列圖Fig.3 Amino acid alignment of MRJP1

2.4 差異性多肽的篩選

除了水分和糖之外,蜂蜜蛋白及其酶解多肽是蜂蜜的第三重要成分,蜂蜜的品質應根據其含有的蛋白質及多肽來確定,其中首先要關注的便是將花蜜轉化為蜂蜜的酶及其酶解產物,其次便是蜂蜜中存在的蜂王漿主要蛋白[24]。另一方面,不同品種的蜂蜜含有各自的特征蛋白及其酶解肽段,也含有區別于其它食物的共同的蛋白及其酶解肽段,特征蛋白及其酶解肽段可以區別蜂蜜的種類,共同蛋白及其酶解肽段則可用來區別蜂蜜和其他食物,因此,也可用來區分未摻假蜂蜜和摻假蜂蜜。基于此,本研究對比了6種蜂蜜酶解后多肽序列發現,4種未摻假蜂蜜中均存在來自于MRJP1的多肽EYILVLSNK,本研究中的2種摻假蜂蜜中未檢測到,且這條肽段所對應的蛋白質(MRJP1)是蜂蜜中的高豐度蛋白。將篩選到的多肽EYILVLSNK在Uniprot上進行蛋白質Blast,所得結果見圖3,該多肽存在于MRJP1第376～384位,其生物詳細信息見表8。由表8可以看出鑒定出的MRJP1含有2個唯一肽段(Unique peptide),且分數為117.39,表明該肽段及其所對應的MRJP1可信度較高。因此,多肽EYILVLSNK可區分本研究中的4種未摻假蜂蜜和2種摻假蜂蜜,也可作為鑒定摻假蜂蜜的潛在特異性多肽。

3 討論與結論

蜂蜜摻假是目前蜂蜜市場上普遍存在的問題,快捷準確的辨別方法對于鑒定蜂蜜摻假具有重要意義。基于蛋白類物質來鑒定蜂蜜摻假主要集中在三個方面:a.分析蜂蜜中氨基酸的種類與含量以確定蜂蜜的來源以及是否摻假[11];b.分析蜂蜜中蛋白質的SDS-PAGE電泳行為差異以確定蜂蜜的差異[10,23];c.通過蜂蜜蛋白的免疫特性差異來區分蜂蜜來源及是否摻假[20,23]。這些方法具有一定的缺點,蜂蜜中氨基酸的種類和含量受地理、蜜源、氣候等多種因素影響具有不穩定性[26];蜂蜜蛋白的電泳行為只能粗略的表現出不同蜂蜜蛋白的差異,無法精確定位差異蛋白;蜂蜜蛋白的免疫特性雖然可以有效區分不同蜂蜜,但是操作復雜,無法適應要求快速檢測摻假蜂蜜的市場。蜂蜜中含有一定量的蛋白質,且不同蜂蜜蛋白質的含量和種類也存在差異,通過酶解蛋白,液相質譜鑒定的手段可直接得出蜂蜜多肽信息,不僅可以反映蜂蜜是否摻假,而且可以快速準確定位摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的差異蛋白,進而鑒定摻假蜂蜜。

本研究采用UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用的方法分析鑒定了4種未摻假蜂蜜及兩種摻假蜂蜜多肽的組成及結構。結果表明,4種未摻假蜂蜜80%以上的肽段來自蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),且含有蜂蜜中大量存在的蜂王漿主要蛋白家族(MRJPs)酶解產生的肽段,2種摻假蜂蜜中未檢測出來自MRJPs酶解產生的多肽,且所有檢測到的多肽對應的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)為1,可信度不高。對比六種蜂蜜蛋白酶解結果發現,4種未摻假蜂蜜中均檢測到了來自蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)的多肽EYILVLSNK,該多肽對應的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)為2,可信度較高,2種摻假蜂蜜中未檢測到多肽EYILVLSNK,多肽EYILVLSNK作為摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的差異肽段,可辨別本研究中的真偽蜂蜜,或可作為鑒定摻假蜂蜜的潛在特異性多肽。這一結果不僅為基于蛋白類物質辨別蜂蜜真偽提供實驗基礎,而且為鑒定摻假蜂蜜提供新的思路。