HPLC-ELSD法測(cè)定長白山篤斯越桔果實(shí)中可溶性糖含量

王 瑜,楊浩博,仲 帥,劉 鑫,盛煜鈞,李 彤,宗成文

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林延吉 133002)

篤斯越桔(Vacciniumuliginosum)是杜鵑花科越橘屬的多年生落葉灌木,在我國主要分布于黑龍江大、小興安嶺、吉林長白山等地[1-2],是我國重要的野生漿果資源,具有較高的研究價(jià)值[3-5]。篤斯越桔果實(shí)中不僅含有豐富的花青苷、黃酮醇苷和原花青素等功能活性成分[6],還有大量的糖酸等影響果實(shí)口感的風(fēng)味物質(zhì)。

果實(shí)的品質(zhì)取決于其可溶性固形物、香味和質(zhì)地等特性,尤其是糖酸含量和比率[7]。隨著果實(shí)成熟,不溶性的淀粉變成可溶性的蔗糖、葡萄糖、果糖等積累于細(xì)胞質(zhì)中,使甜味增加[8]。可溶性糖是衡量果實(shí)甜度和風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)[9],也是色素、氨基酸、維生素和芳香物質(zhì)等其他營養(yǎng)成分合成的基礎(chǔ)原料[10]。關(guān)軍鋒[11]研究指出水果中的可溶性糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖。有的水果還含有木糖、山梨醇、甘露醇等[12]。不同種類甚至同一種類不同品種的水果,可溶性糖構(gòu)成可能存在差異,多數(shù)水果以果糖、蔗糖和葡萄糖中的某一種為主[13]。

果實(shí)中可溶性糖的測(cè)定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法等[14]。分光光度法儀器設(shè)備簡單,操作簡便,但準(zhǔn)確度相對(duì)不高;氣相色譜在使用前需要對(duì)不易揮發(fā)的糖進(jìn)行衍生化反應(yīng),過程繁瑣復(fù)雜;高效毛細(xì)管電泳法分離較好,但是穩(wěn)定性較差,所測(cè)數(shù)據(jù)精密度、重復(fù)性不高[15-16];高效液相色譜法的高效性、簡便性、靈敏度以及測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性、精密度都很高,近幾年在沙棘[17]、藍(lán)果忍冬[18]、黑果醋栗[19]等漿果中廣泛使用。測(cè)定可溶性糖含量的檢測(cè)器與測(cè)定有機(jī)酸的檢測(cè)器不同,主要有示差折光檢測(cè)器(RID)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。RID雖然能檢測(cè)出糖含量,但是其檢測(cè)靈敏度低,受溫度影響大;ELSD其穩(wěn)定性好、靈敏度高、精密度高、無溶劑峰干擾[20-22]。本試驗(yàn)建立并優(yōu)化HPLC-ELSD法測(cè)定篤斯越桔果實(shí)可溶性糖含量的方法,比較長白山區(qū)2個(gè)不同居群篤斯越桔果實(shí)糖含量,篩選出高糖種質(zhì),以期為篤斯越桔果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)、生產(chǎn)加工及種質(zhì)資源保存利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篤斯越桔成熟果實(shí) 以長白山區(qū)的東方紅林場(chǎng)(平均海拔1253 m)和蘭家林場(chǎng)(平均海拔836 m)采集2個(gè)不同天然居群(每個(gè)居群20個(gè)樣本,每兩個(gè)樣本間距30 m)共40個(gè)(盛花后60 d),在采樣后選擇未受損害的成熟果實(shí)留樣速凍置于-20 ℃冰箱中保存,在全部采樣后進(jìn)行可溶性糖分析;果糖(99.7%)、葡萄糖(98.7%)、蔗糖(99.5%) 北京壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;乙腈 色譜純,天津市賽孚瑞科技有限公司。

Primaide高效液相色譜儀 日本Hitachi有限公司;ELSD3300檢測(cè)器 美國Alltech公司;TCL-16G型高速心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ-250B型超聲波清洗器 總功率750 W、頻率40 kHZ,昆山市超聲儀器有限公司;ME204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件的選擇 在流動(dòng)相(乙腈∶水=70∶30,V/V)、流速(1.0 mL·min-1)等為最初研究條件下,本試驗(yàn)優(yōu)化了3個(gè)柱溫,分別是30、35和50 ℃;流動(dòng)相中乙腈比例的增大會(huì)影響基線的噪音及各峰的分離度,所以測(cè)試了在柱溫(35 ℃)、流速(1.0 mL·min-1)等條件不變的情況下,當(dāng)流動(dòng)相中乙腈:水分別為70∶30、75∶25、80∶20 (V/V)時(shí)的分離度;ELSD檢測(cè)器的漂移管溫度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要參數(shù),本試驗(yàn)在流動(dòng)相為乙腈和水的體積比為75∶25,流速為1 mg·min-1,柱溫為35 ℃不變的條件下,設(shè)置漂移管溫度為50和80 ℃兩個(gè)條件,來檢測(cè)是否達(dá)到理想的分離效果。

最終確定的色譜條件為:ELSD Alltech 3300檢測(cè)器;色譜柱為CAPCELL PAK NH2UG80 S5(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(75∶25,v∶v);流速1.0 mL·min-1;柱溫35 ℃;漂移管溫度80 ℃;載體為高純N2,流速為1.0 L·min-1;進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖各100 mg,用超純水溶解并定容于10 mL容量瓶中,搖勻,0.45 μm濾膜過濾,得到可溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。用超純水稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)品母液,得到果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1的一系列混標(biāo)溶液,放入4 ℃冰箱待測(cè)。以可溶性糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積(mV)為縱坐標(biāo),建立線性回歸方程。

1.2.3 樣品溶液的制備 精密稱取1 g在蘭家林場(chǎng)采集的篤斯越桔果實(shí),加入5 mL超純水研磨成勻漿,倒入5 mL離心管中,室溫下超聲處理5 min后,12000 r·min-1下離心15 min,收集上清液。濾渣按上述方法再提取一次,合并提取液,用超純水定容至20 mL,0.45 μm水系濾膜過濾,待測(cè)。

1.2.4 方法學(xué)的考察

1.2.4.1 精密度試驗(yàn) 將1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算精密度及果糖、葡萄糖、蔗糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD1)。

1.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取篤斯越桔果實(shí),按1.2.3的樣品溶液的制備方法分別提取6份,分別進(jìn)樣,計(jì)算樣品各可溶性糖峰面積的RSD2。

1.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精確量取1 mL樣品,加入果糖質(zhì)量濃度為1.25 mg·mL-1和葡萄糖質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL;各待測(cè)液混合后,用0.45 μm水系濾膜過濾,根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與檢出質(zhì)量濃度來計(jì)算回收率,實(shí)驗(yàn)平行6次。

1.2.6 篤斯越桔果實(shí)可溶性糖含量的測(cè)定 將篤斯越桔果實(shí)按照1.2.3的方法制備三份,按照1.2.1的色譜條件進(jìn)樣分析,根據(jù)峰面積算出篤斯越桔果實(shí)中果糖、葡萄糖的含量,并根據(jù)果糖,葡萄糖算出總糖含量。甜度值的計(jì)算參照姚改芳等[23]的方法,蔗糖的甜度值為1.00,果糖為1.75,葡萄糖為0.70,甜度值=蔗糖含量×1.00+果糖含量×1.75+葡萄糖含量×0.70。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)三次重復(fù)。采用Excel 2010處理原始數(shù)據(jù)以及平均值、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算。采用SPSS 19.0(IBM Co.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較(Ducan法,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 柱溫的確定 由圖1可見,隨著柱溫的升高,各組分在色譜柱內(nèi)的保留時(shí)間都有所縮短,但在50 ℃時(shí)果糖和葡萄糖分離效果不好,在30 ℃時(shí),蔗糖有雜峰,且沒有從基線分離出來,故選擇35 ℃作為柱溫。

圖1 不同柱溫下可溶性糖的色譜圖Fig.1 Chromatograms of soluble sugars under different column temperature注:A:柱溫為30 ℃;B:柱溫為35 ℃;C:柱溫為50 ℃。

2.1.2 流動(dòng)相比例的確定 由圖2可知,提高乙腈的比例可以更好的提高糖的分離程度,當(dāng)流動(dòng)相乙腈和水體積比為75∶25時(shí),相鄰兩峰分離效果較好,且分離時(shí)間較短,在10 min以內(nèi)就可以分析一個(gè)樣品,綜合考慮保留時(shí)間及分離度,采用乙腈和水的體積比為75∶25作為流動(dòng)相。

圖2 乙腈和水不同體積比的可溶性糖色譜圖Fig.2 Chromatogram of soluble sugars in different volume ratio of CH3CN and H2O注:A:乙腈和水的體積比為70∶30;B:乙腈和水的 體積比為75∶25;C:乙腈和水的體積比為80∶20。

2.1.3 漂移管溫度的確定 漂移管溫度會(huì)影響檢測(cè)器的靈敏度。根據(jù)文獻(xiàn)指出由于漂移管溫度過低時(shí)流動(dòng)相蒸發(fā)不完全,導(dǎo)致基線噪音上升,分離不完全;溫度過高時(shí)流動(dòng)相又會(huì)完全蒸發(fā),導(dǎo)致信噪比增大[21]。所以最佳溫度需要通過觀察各溫度時(shí)信噪比和分離度來確定。如圖3,漂移管溫度為50 ℃,果糖和葡萄糖沒有達(dá)到基線分離,綜合考慮選擇漂移管溫度為80 ℃。

圖3 不同漂移管溫度下可溶性糖的色譜圖Fig.3 Chromatogram of soluble sugars in different drift tube temperature注：A:漂移管溫度為50 ℃；B:漂移管溫度為80 ℃。

2.2 HPLC圖譜分析

取果糖、葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)溶液,進(jìn)樣5 μL,色譜圖見圖4A。由圖4A可以看出,3種可溶性糖基本達(dá)到基線分離,峰形良好。取篤斯越桔樣品溶液,進(jìn)樣5 μL,色譜圖見圖4B。由圖4B可知,篤斯越桔果實(shí)中主要含有果糖、葡萄糖,兩種糖分離度較好。并沒有檢測(cè)出蔗糖及其他可溶性糖,這與對(duì)越桔糖酸組分及含量分析中的可溶性糖主要有果糖和葡萄糖為主的研究結(jié)果大致相同[24],與張英春等[16]報(bào)道不同的是,本試驗(yàn)沒有檢測(cè)出蔗糖,這可能與大興安嶺地區(qū)與長白山地區(qū)生長環(huán)境以及遺傳與其他環(huán)境因素多因素共同作用的結(jié)果[25-27]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的回歸方程、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 表1的結(jié)果顯示,通過將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋的6個(gè)濃度梯度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1)所成的線性相關(guān)系數(shù)在0.9994～0.9995之間,說明糖酸組分的峰面積與含量的線性關(guān)系良好。糖組分測(cè)定的RSD1在1.08%～2.09%之間,RSD2在0.80%～2.73%之間,表明該方法重復(fù)性良好,所用儀器的精密度良好。

表1 糖組分的線性回歸方程及精密度和重復(fù)性(n=6)Table 1 Linearity,precision and repeatability determination of sugar(n=6)

表2 可溶性糖測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 2 Recovery rates of soluble sugars in spiked samples(n=6)

圖4 優(yōu)化條件下糖標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.4 The sugars standard(A)and sample(B) chromatograms under optimization conditions

2.3.2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 兩種可溶性糖的平均回收率為102.83%和106.29%,表明方法準(zhǔn)確率高。結(jié)果如表2所示。

2.4 不同居群長白山篤斯越桔果實(shí)中糖含量

篤斯越桔果實(shí)內(nèi)果糖含量最多,其次為葡萄糖。表3方差分析結(jié)果顯示,篤斯越桔果實(shí)中的果糖、葡萄糖、總糖和甜度值在不同居群間差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。

不同居群內(nèi)可溶性糖含量顯著(P<0.05)(表4),海拔高的東方紅林場(chǎng)果糖、葡萄糖和總糖的平均含量高于蘭家林場(chǎng),東方紅林場(chǎng)的平均甜度值達(dá)到85.33,遠(yuǎn)高于蘭家林場(chǎng)的56.61。DFH-11(東方紅居群內(nèi)第11個(gè)樣本)的果糖含量顯著高于居群內(nèi)其他19個(gè)樣本(P<0.05);DFH-11和DFH-14的葡萄糖含量顯著高于居群內(nèi)其他樣本(P<0.05),總糖含量最高的是DFH-11,為89.37 mg·g-1FW,含量最低的是DFH-16,僅有38.79 mg·g-1FW。東方紅林場(chǎng)內(nèi)甜度最高的是DFH-11,高達(dá)110.77。蘭家林場(chǎng)中LJ-6樣本果糖、葡萄糖和總糖含量顯著(P<0.05)高于居群內(nèi)其他樣本;甜度值最高的是LJ-6樣本,為88.63,但與東方紅林場(chǎng)的DFH-11樣本相比,低了22.14。因此DFH-11具有潛在的應(yīng)用前景,是長白山篤斯越桔育種工作的首選材料。

表3 不同居群篤斯越桔果實(shí)可溶性糖含量的方差分析Table 3 The ANOVA analysis of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

表4 不同居群篤斯越桔果實(shí)可溶性糖含量的多重比較Table 4 Multiple comparison of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用HPLC-ELSD法對(duì)長白山區(qū)不同居群篤斯越桔果實(shí)可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定,并建立優(yōu)化建立穩(wěn)定準(zhǔn)確的色譜條件。結(jié)果顯示,HPLC-ELSD法簡便快捷,靈敏度高,能夠準(zhǔn)確測(cè)定出篤斯越桔果實(shí)中可溶性糖含量。長白山篤斯越桔果實(shí)糖分主要為果糖和葡萄糖。2個(gè)居群中海拔高的東方紅林場(chǎng)的果糖、葡萄糖、總糖含量及甜度值明顯高于海拔低蘭家林場(chǎng)。居群內(nèi)糖含量及甜度值差異顯著,2個(gè)居群40個(gè)樣本中DFH-11的總糖含量及甜度值最高,具有潛在的應(yīng)用前景,是長白山篤斯越桔育種工作的首選材料。劉玉蘭[28]指出總糖對(duì)釀酒葡萄的品質(zhì)、口感以及深加工有很大影響,可見本試驗(yàn)為高效利用優(yōu)異種質(zhì)資源提供理論依據(jù),對(duì)篤斯越桔資源開發(fā)利用和保護(hù)有重要意義。

續(xù)表

注:不同小寫字母代表相同林場(chǎng)相同指標(biāo)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。