菲律賓蛤仔不同組分中重金屬存在形態(tài)研究

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(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023; 2.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,浙江杭州 310016)

菲律賓蛤仔是沿海主要養(yǎng)殖的海產(chǎn)貝類之一[1],味道鮮美且具有較高的營養(yǎng)價值,氨基酸的類別組成及含量比例合理[2]，含有各類維生素及藥用成分以及人體必需的多種微量元素,因此備受青睞。但其因濾食性、活動性差等生活特點易受到如重金屬等污染物的污染[3],重金屬超標(biāo)的貝類產(chǎn)品不僅會威脅人們的身體健康,還會影響產(chǎn)品的出口貿(mào)易制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展。金屬元素不僅可以溶解狀態(tài)存在,還會以顆粒態(tài)形式存在[4]。顆粒態(tài)重金屬的形成過程是重金屬與有機(jī)配位基和形成絡(luò)合物的電子供體相結(jié)合,因此呈現(xiàn)多種形態(tài),相關(guān)研究表明,金屬元素在食品中存在形態(tài)對生物吸收利用率產(chǎn)生關(guān)鍵影響[5]。不同的存在形態(tài)會極大地影響其生物的吸收、利用及體內(nèi)分布,造成不同的生物效應(yīng)或產(chǎn)生生理毒害作用[6]。不同存在形態(tài)的顆粒態(tài)重金屬的結(jié)合強(qiáng)度差異較大,因此導(dǎo)致生物效應(yīng)不同,穩(wěn)定性強(qiáng)弱依次為可交換態(tài)>硫化物結(jié)合態(tài)>結(jié)合態(tài)>殘渣態(tài)[7]。可交換態(tài)金屬對環(huán)境的變化最為敏感,且最易被生物體吸收,硫化物結(jié)合態(tài)是酸可提取態(tài),可交換態(tài)金屬和硫化物結(jié)合態(tài)屬于相對易可給態(tài)重金屬;有機(jī)物結(jié)合態(tài)和殘渣態(tài)對環(huán)境變化不敏感,不易被生物吸收,均屬于惰性態(tài)重金屬,且殘渣態(tài)對生物無效應(yīng)[8]。

近年來有關(guān)形態(tài)分析的報道逐漸增多,如Brezonik等[9]及Foerstner等[10]都對形態(tài)分析作了專題討論。逐級化學(xué)提取法(SCEE)又稱逐級提取或連續(xù)提取,可將復(fù)雜體系中不同存在形態(tài)的顆粒態(tài)重金屬提取出來,便于之后的分析討論[11]。此方法基于Tessier五步連續(xù)提取法,根據(jù)研究土壤中微量元素存在狀態(tài)的方法進(jìn)行改進(jìn)而發(fā)展起來[12],在定量研究重金屬元素存在狀態(tài)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)不同形態(tài)元素的溶解度在溶劑中交換強(qiáng)度的差異,將樣品中的顆粒態(tài)重金屬依次提取到目標(biāo)溶液中[13]。選擇合適的重金屬元素提取劑,依次提取可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)物結(jié)合態(tài)、殘渣態(tài)(形態(tài)劃分由Siebielec等[14]確立)。提取的各種形態(tài)之和應(yīng)該等于元素的總量[15],所以可由回收率對方法的可行性進(jìn)行檢測,但是由于城市空氣中存在重金屬的懸浮物,可能會造成提取的一部分重金屬并不全來源于樣品中,所以此方法也存在一定的誤差[16]。許多學(xué)者對菲律賓蛤仔和牡蠣中的金屬進(jìn)行了深入研究,呂永紅[17]的研究證實了各種濃度的鎘離子對菲律賓蛤仔呼吸過程均具有較顯著的抑制作用;孟慧等[18]研究實驗發(fā)現(xiàn)牡蠣中鋅的主要存在形態(tài)是無機(jī)態(tài),且有少量以有機(jī)結(jié)合態(tài)形式存在;蔡立哲等[19]實驗結(jié)果顯示,菲律賓蛤仔的鰓和軟體部位的鉛、鋅含量與實驗水體中的鉛、鋅濃度成正比,但鰓對鉛、鋅的積累量較高。仇紅萍[20]對牡蠣的研究中發(fā)現(xiàn)牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中的鎘元素超出國家食品衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)范圍。

本文將逐級化學(xué)提取技術(shù)應(yīng)用到菲律賓蛤仔中重金屬元素的形態(tài)研究上,并驗證其可行性。實驗以鉛、鋅、鎘三種重金屬為例研究菲律賓蛤仔中重金屬元素分布及存在形態(tài),將新鮮的菲律賓蛤仔通過差速離心制備成細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體三種組分,分別測定這三種組分的鉛、鎘、鋅重金屬含量及存在形態(tài),根據(jù)重金屬含量的測定結(jié)果得出重金屬在細(xì)胞中的分布及存在形態(tài)特點,可為以后評估貝類中的重金屬毒性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔 體長2～3 cm,采購于大連長興市場;氯化鈉、濃硝酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠;鉛、鋅、鎘重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液 單標(biāo),國家有色重金屬及電子材料分析測試中心;氯化鎂、30%過氧化氫 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;超純水 實驗室自制。

FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;FW高速萬能粉碎機(jī)、可調(diào)試電陶爐 天津市泰斯特儀器有限公司;GZX-GF型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;KQ-C玻璃儀器氣流烘干器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;Optima 8000 ICP原子發(fā)射光譜儀 美國PerkinElmer公司;Milli-Q超純水儀 法國Millipore;AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘怡實驗儀器開發(fā)有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;PB-10酸度計 Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組分制備 將采購的新鮮菲律賓蛤仔先用過濾海水沖凈其表面的淤泥、臟雜物等附著物,選擇殼體無破損、正常活動、大小基本一致的蛤仔放入冰柜冷凍,次日取出,稱取1.5 kg,于室溫稍微解凍后除去外殼,用大張濾紙吸干蛤肉上多余的水分,保留整體蛤肉并稱重,之后將蛤肉剪碎,加入兩倍蛤肉體積的0.75%氯化鈉溶液,用均質(zhì)機(jī)粉碎,粉碎得到的原液進(jìn)行差速離心,以轉(zhuǎn)速2000×g離心10 min,沉淀物即為細(xì)胞核組分,將上清液繼續(xù)以10000×g的離心10 min,上清液即為細(xì)胞質(zhì)組分,沉淀物為線粒體組分,凍干并打粉,于-20 ℃干燥條件下存儲。

1.2.2 重金屬含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲備液):取1個已泡酸的容量瓶(100 mL),按表1加入重金屬標(biāo)準(zhǔn)液,用HNO3(0.5%)定容,搖勻備用。

表1 金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲備液)配制方法Table 1 Preparation method of metal standard solution(stock solution)

重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(工作液):取7個已泡酸的50 mL石英瓶,分別加入0、1.0、5.0、10.0、18.0、25.0、35.0 mL重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲備液),用0.5%硝酸定容至刻度,搖勻備用。將定容好的重金屬標(biāo)準(zhǔn)液(工作液)用原子發(fā)射光譜儀按濃度從低到高依次進(jìn)行測定,根據(jù)測得的強(qiáng)度值與工作液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品濕法消化 準(zhǔn)確稱取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體各0.2 g,分別加入10 mL優(yōu)級純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補(bǔ)加幾毫升硝酸繼續(xù)消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于100 mL的容量瓶內(nèi)[21],同時做空白實驗。

1.2.2.3 樣品重金屬含量測定 檢測條件為:等離子體氣流量20 L/min;輔助氣流量0.3 L/min;霧化器氣體流量0.24 L/min;蠕動泵轉(zhuǎn)速:1.0 mL/min。Pb、Zn、Cd這3種重金屬元素的檢測波長分別是:220.35、206.20、228.80 nm。

將樣品消化液用0.45 μm過濾器過濾,并稀釋10倍,進(jìn)樣前先用0.5%硝酸沖洗系統(tǒng)3～5 min,先對空白樣進(jìn)行測定。每進(jìn)一組平行待測樣沖洗一次,每次沖洗2 min,記錄實驗數(shù)據(jù)。測定結(jié)束先用5%硝酸沖洗10 min,再用超純水沖洗10 min,最后將進(jìn)樣孔暴露于空氣中使整個系統(tǒng)將液體排空。

1.2.2.4 重金屬含量計算 用原子發(fā)射光譜儀測出的數(shù)據(jù)為強(qiáng)度,將強(qiáng)度代入標(biāo)曲求出X值。

重金屬含量(mg/g)=X×V×A/M

式中：V-容量瓶體積(mL);A-稀釋倍數(shù);M-樣品重量(g);X-溶液濃度值(mg/mL)。

1.2.2.5 可交換態(tài)重金屬的提取 準(zhǔn)確稱取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體各0.1 g,每個樣品進(jìn)行三次平行實驗分別加入15 mL 1 mol/L MgCl2溶液,在室溫下振蕩4 h,以 4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶內(nèi)[22]。

1.2.2.6 硫化物結(jié)合態(tài)重金屬的提取 將離心所得沉淀物分別用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,棄掉上清液,取殘余物分別添加15 mL HNO3溶液,置于100 ℃水浴中加熱30 min,間歇振蕩,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.7 有機(jī)物結(jié)合態(tài)重金屬的提取 硫化物結(jié)合態(tài)獲得的沉淀物各用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,將上清液棄掉,取殘余物分別加10 mL超純水,以稀硝酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0,加入5 mL 30%的H2O2,置于80～85 ℃水浴中加熱約5 h,間歇振蕩,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.8 殘渣態(tài)重金屬的提取 有機(jī)物結(jié)合態(tài)得到的殘余物分別用10 mL超純水漂洗,離心,將上清液棄掉,取殘余物。加入10 mL優(yōu)級純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補(bǔ)加幾毫升酸液繼續(xù)消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于50 mL的容量瓶內(nèi),用封口膜纏繞放入冰箱中冷藏。取與消化樣相同量的酸液,按上述步驟做空白試驗[23]。

1.2.2.9 各存在形態(tài)金屬含量及回收率測定 采用原子發(fā)射光譜法[24]測定提取后各存在形態(tài)金屬元素的發(fā)射光強(qiáng)度,由工作曲線算出相應(yīng)的含量[25],具體操作方法同1.2.2.3樣品重金屬含量測定。

各種重金屬回收率計算公式如下:

回收率(%)=重金屬各存在形態(tài)含量之和/重金屬總量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定三次,測定結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05時認(rèn)為數(shù)據(jù)具有顯著性差異。實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析與作圖計算各形態(tài)在各組分的占比情況,用原子發(fā)射光譜儀測出的數(shù)據(jù)為強(qiáng)度,將強(qiáng)度值代入標(biāo)曲求出X值,即為各形態(tài)在各組分的含量,并計算相應(yīng)百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級離心制備細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)組分

1.5 kg菲律賓蛤仔得到貝肉重量約為500 g,經(jīng)過分級離心所得到的細(xì)胞核組分凍干粉質(zhì)量為43.77 g,占比約為46.37%;線粒體組分凍干粉質(zhì)量為16.08 g,占比約為17.03%;細(xì)胞質(zhì)組分凍干粉質(zhì)量為34.55 g,占比約為36.60%;其中細(xì)胞核組分含量最高,線粒體組分含量最低。

2.2 重金屬在各組分中的含量、回收率及存在形態(tài)

2.2.1 重金屬在各組分中的含量

2.2.1.1 鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鉛含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=25649x+1568.8,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9924。

圖1 金屬鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for metallic plumbum

2.2.1.2 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鋅含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=285405x-12153,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9919。

圖2 金屬鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for metallic zinc

2.2.1.3 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鎘含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=289025x-5159.7,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9968。

圖3 金屬鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of metallic cadmium

2.2.1.4 重金屬在各組分中的含量計算 三種金屬在三種組分中的含量測定結(jié)果如表2所示,鉛和鎘在細(xì)胞質(zhì)中含量最高,鋅主要存在于細(xì)胞核和線粒體中。在各組分中,鋅含量均為最高，菲律賓蛤仔是一種富鋅食物。鋅是人體的必需微量元素,每天攝入10～20 mg是對人體有益的，但是當(dāng)人體每天攝入鋅含量超過40 mg以上,對人體有一定的毒性。與鋅元素不同,鉛和鎘是有毒重金屬,由于樣品含量以干重計算,鉛和鎘元素含量相對生鮮貝類較高。

表2 重金屬在各組分中的含量(干重,mg/g)Table 2 Contents of heavy metal in each component(dry weight,mg/g)

2.2.2 鉛在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖4所示,在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)這三種組分中重金屬鉛主要以硫化物結(jié)合態(tài)存在,所占的比例分別為75.24%、50.71%和71.29%,其余三種形態(tài)均未檢出,說明逐級化學(xué)提取技術(shù)對貝類中鉛元素存在形態(tài)檢測的回收率不高。硫化物結(jié)合態(tài)是一種易于提取的元素狀態(tài)，雖然不如可交換態(tài)易于入環(huán)境,但比有機(jī)物結(jié)合態(tài)活潑,在一定條件下容易釋放出來的。所以菲律賓蛤仔各組分中的鉛元素相對易于進(jìn)入環(huán)境,易被人體吸收。

圖4 鉛在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.4 Different forms of metallic plumbum in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.3 鋅在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖5所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鋅在四種形態(tài)中都存在,其中,在細(xì)胞核中鋅的殘渣態(tài)含量最高為34.51%,殘渣態(tài)重金屬在自然條件下釋放的可能性極小,能長期穩(wěn)定存在,不易被生物體富集,說明在細(xì)胞核鋅元素大部分比較穩(wěn)定[26]。線粒體中鋅的可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和殘渣態(tài)含量相近。細(xì)胞質(zhì)中鋅主要以可交換態(tài)存在,所占比例為35.21%,而交換態(tài)是最易被生物體吸收利用的形態(tài),由于生物可利用態(tài)的含量最高,所以在細(xì)胞質(zhì)中鋅元素大部分比較活躍[27]。說明鋅元素在菲律賓蛤仔各組分中存在形態(tài)相差較大,細(xì)胞核中主要以穩(wěn)定的殘渣態(tài)存在,在細(xì)胞質(zhì)中以活潑的可交換態(tài)存在。

圖5 鋅在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.5 Different forms of metallic zinc in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.4 鎘在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖6所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和有機(jī)物結(jié)合態(tài)這三種可利用態(tài)金屬的形態(tài)存在,基本沒有以殘渣態(tài)存在的鎘元素,因為殘渣態(tài)是最穩(wěn)定的金屬存在形態(tài),也叫穩(wěn)定態(tài)[28],所以菲律賓蛤仔各細(xì)胞器組分中的重金屬鎘沒有最穩(wěn)定的穩(wěn)定態(tài)。其中鎘在細(xì)胞核和線粒體中的形態(tài)分布相同,有機(jī)物結(jié)合態(tài)所占比例最高分別為43.03%和40.74%,其次是硫化物結(jié)合態(tài),所占比例分別為32.07%和31.57%,可交換態(tài)含量較少,分別為23.98%和20.73%。鎘在細(xì)胞質(zhì)中存在形態(tài)的分布與細(xì)胞核和線粒體中的不同,可交換態(tài)含量最高,所占比例為47.38%,說明細(xì)胞質(zhì)中的鎘元素更易釋放到環(huán)境中。

圖6 鎘在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.6 Different forms of metallic cadmium in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

從菲律賓蛤仔各組分重金屬存在形態(tài)來看,在細(xì)胞核和線粒體中,鋅和鎘主要以有機(jī)物結(jié)合態(tài)和殘渣態(tài)存在,較穩(wěn)定,不易釋放;在細(xì)胞質(zhì)中,鉛、鋅和鎘主要以可交換態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)形式存在,易于釋放到環(huán)境中,易于被人體吸收。

2.2.5 逐級化學(xué)提取法提取重金屬元素回收率 由表3可知,不同重金屬元素在不同組分中回收率不一樣,重金屬元素在不同組分中回收率為50.71%～99.18%。其中Cd回收率最高,回收率為93.04%～99.18%。說明采用逐級化學(xué)提取法分析菲律賓蛤仔組分中重金屬存在形態(tài)是可行的。

表3 重金屬元素回收率(%)Table 3 Recovery rate of heavy metal element(%)

3 結(jié)論

綜上所述,通過差速離心得到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體三種組分,采用原子發(fā)射光譜法分析研究三種組分中鉛、鋅、鎘三種重金屬含量及金屬存在形態(tài)。結(jié)果表明,采用逐級化學(xué)提取法分析菲律賓蛤仔細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)三種組分中重金屬鉛、鋅、鎘是可行的。菲律賓蛤仔中的重金屬鉛主要以硫化物結(jié)合態(tài)存在,在一定條件下還是容易釋放到環(huán)境中;重金屬鋅在四種形態(tài)中都存在,其中鋅在細(xì)胞核中的殘渣態(tài)含量最高,細(xì)胞質(zhì)中鋅主要以可交換態(tài)存在;菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和有機(jī)物結(jié)合態(tài)這三種形態(tài)存在,基本沒有以殘渣態(tài)存在的鎘元素。綜上,菲律賓蛤仔細(xì)胞質(zhì)中鉛、鋅、鎘三種金屬易于釋放;細(xì)胞核、線粒體中鋅、鎘兩種元素相對穩(wěn)定。食品中的重金屬在與生物成分結(jié)合后,會形成多種形態(tài),造成毒性的改變,但在實際的人體代謝過程中,其形態(tài)是否改變,還有待進(jìn)一步研究。