靈芝菌生物發酵北五味子果汁降酸工藝優化及其護肝作用

辛 宇,邱智東,伍法杰,張彥飛,曲 墨,羅浩銘,王偉楠

(長春中醫藥大學藥學院,吉林長春 130117)

北五味子(Schisandrachinesis(Turcz.)Baill)是我國傳統的藥食同源中藥材,其主要成分為木脂素、揮發油、多糖、多酚、有機酸等成分[1-2]。因其具有極高的營養價值和藥理保健功能,被認為是品質優良的食品和藥品原料[3-5]。然而,北五味子中的可滴定酸含量與檸檬接近,酸度過高導致北五味子糖酸比例不協調、口感風味不佳,高濃度的有機酸和較低的pH對人體牙釉質和牙本質也具有腐蝕作用,制約了北五味子果汁的深度開發[6-9]。因此在保持濃郁香氣和營養成分的前提下,降低酸度是改善北五味子口感和生產北五味子保健產品的重要途徑。

目前降酸的方法主要有化學法、樹脂法和生物法[10-11]。化學降酸法是通過加入CaCO3等化學試劑,使其發生中和反應來降低果汁中的部分有機酸,但這種方法在果汁儲藏過程中會產生鹽類沉淀,且外源性化學試劑的加入也會對降酸后的產品使用安全性造成影響;樹脂降酸法主要采用堿性離子交換樹脂對北五味子果汁中的酸性成分進行吸附,以達到降酸目的,但會使北五味子果汁中的營養成分大量流失,在降酸的同時也降低了北五味子果汁的附加值;生物降酸法主要是利用微生物代謝,在一定的條件下,分解北五味子果汁中的有機酸,形成酸度較低的其他活性物質,從而達到降低酸度的目的,該方法相較上述兩種方法而言,具有條件綠色、反應溫和、食用安全性高等優點,可以作為北五味子果汁降酸的主要手段。

目前有關北五味子果汁生物降酸國內還未見報道,因此本文通過菌種篩選確定靈芝菌作為果汁生物降酸實驗研究的菌種,進而利用生物法降低北五味子果汁中有機酸的含量,為高品質、高營養價值的北五味子高端保健飲品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北五味子新鮮果實 吉林省北佳中藥科技開發有限公司提供,長春中醫藥大學藥學院中藥品種質量鑒定實驗室鑒定為北五味子(Schisandrachinesis(Turcz.)Baill);靈芝菌(Ganodermalucidum,CGMCC編號5.644) 中國普通微生物菌種保藏管理中心提供;健康Wistar大鼠(雄性,150～200 g,許可證號:SCXK(吉)2018-0007) 長春市億斯實驗動物有限公司提供,自由進食進水適應環境一周,備用;無水葡萄糖標準品、沒食子酸標準品、蘆丁標準品 純度>98%,中國藥品生物制品檢定所;色譜甲醇 色譜純,美國Thermo Fisher公司;硫酸鎂、碳酸鈣、硫酸錳、磷酸二氫鉀、葡萄糖、維生素B1分析純，西隴科學股份有限公司;蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉 生化試劑,北京奧博星生物技術有限責任公司;丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒 南京建成生物。

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;pHBJ-260型便攜式pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;TG328A(S)分析天平 上海精科分析儀器廠;EL-204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-500B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;TU-1080紫外-可見分光光度計 北京普析通用有限責任公司;冷凍干燥機 美國labconco公司;Sorvall Evolution RC離心機 美國Sorvall公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 北五味子果汁的處理 將北五味子新鮮果實放入干凈的大燒杯中,除去果梗,用16層紗布擠出果汁,分離果肉和種子,測定果汁體積后進行冷凍干燥,得到凍干粉末,密封避光低溫保存,備用。計算得到果汁凍干粉的得率約為5%。

果汁凍干粉得率(%)=(凍干粉重量/原果汁體積)×100

1.2.2 菌種的復蘇、復壯及種子液的制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養基的制備:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉15 g/L。種子液培養基的制備:蛋白胨10 g/L、酵母浸粉2 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、硫酸錳0.1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、維生素B110 mg/L、蒸餾水1 L、自然pH。

將靈芝菌斜面從低溫冷藏冰箱中取出,迅速移至30 ℃水浴中加熱30 min后,擦干試管表面,將斜面放置在28 ℃的微生物培養箱中培養12 h后,取出接種到新的PDA斜面培養基中,在28 ℃的微生物培養箱中培養4～5 d,待白色菌絲長滿斜面之后,向斜面試管中加入1/5試管體積的生理鹽水,旋渦振蕩10 s,將孢子懸液轉移到無菌三角瓶中,利用血球計數板法將孢子懸液濃度調節至1×107spores/mL,備用。取一定體積的孢子懸液按照體積比1∶20加入液體培養基中,于28 ℃恒溫培養培養5～6 d后,即得靈芝菌搖瓶種子液。

1.2.3 北五味子果汁生物發酵工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗 將北五味子果汁凍干粉溶于20倍體積的蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌20 min,無菌條件下放至室溫后轉移至28 ℃的恒溫搖床中備用。固定接種量5%(V/V)、接種菌齡5 d、振蕩速度160 r/min,依次考察發酵時間0、2、4、6、8、10、12、14、16 d的果汁pH,繪制pH變化曲線作為最適發酵時間選擇的依據;固定發酵時間12 d、接種菌齡為5 d、振蕩速度160 r/min,依次考察接種量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(V/V)對果汁pH變化的影響;固定接種量5%(V/V)、振蕩速度160 r/min、發酵時間12 d,依次考察接種菌齡2、3、4、5、6、7 d對果汁pH變化的影響;固定接種菌齡3 d、接種量5%(V/V)、發酵時間12 d,依次考察振蕩速度140、160、180、200 r/min對果汁pH變化的影響;固定接種菌齡3 d、接種量5%(V/V)、發酵時間12 d、振蕩速度180 r/min,依次考察生長因子維生素B1濃度0、5、10、20、40、80 mg/L對果汁pH變化的影響。

1.2.3.2 正交試驗 根據1.2.3.1結果選擇4個主要因素進行L9(34)四因素三水平的正交設計,分析各因素對北五味子果汁pH的影響,確定最佳發酵工藝,并對結果進行驗證,正交因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels design for orthogonal experiments

1.2.4 北五味子果汁生物發酵過程及發酵產物處理 根據優化后的工藝獲得北五味子生物發酵產物。將發酵產物在60 ℃下超聲振蕩60 min,取出,在10000 r/min下,離心15 min,取上清液,即得北五味子發酵果汁;將北五味子發酵果汁于-50 ℃,8 Pa凍干,稱重,密封避光低溫保存,備用。

1.2.5 pH和酸度測定 pH采用精密pH計直接測定;酸度采用酸堿滴定法測定[12]。

式中:CNaOH:滴定所用NaOH溶液的濃度,g/L;VNaOH:滴定所用NaOH溶液體積,mL;VSC:被滴定的北五味子果汁體積,mL。

1.2.6 多糖含量測定方法

1.2.6.1 標曲的建立 精密稱量無水葡萄糖標準品,置100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,配成濃度為0.1016 mg/mL的標準品溶液,分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標準品溶液,繪制標準曲線[13-14]。建立回歸方程為y=0.05656x-0.02524,R2=0.9995,標準品溶液在1.27～12.7 μg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.2.6.2 供試品溶液的制備及其多糖含量的計算 稱量50.6 mg北五味子鮮果果汁凍干粉末和50.7 mg北五味子發酵物凍干粉末,分別加入25 mL蒸餾水,充分溶解、過濾,續濾液定容至25 mL配成供試品溶液;精密吸取發酵前后的供試品溶液各0.4 mL,按照1.2.6.1中的方法處理后,以不含樣品的溶液為空白對照,測定其在490 nm波長下的吸光度值,并根據標準曲線方程計算鮮果汁和發酵物中多糖的含量,該實驗平行三次,測定結果以平均值計。

1.2.7 多酚含量測定方法

1.2.7.1 標準曲線的建立 精密稱量沒食子酸標準品,用蒸餾水定容,配成濃度為0.1024 mg/mL的對照品溶液,分別精密量取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mL標準品溶液,繪制標準曲線[15-18]。建立回歸方程為y=0.12095x+0.06581,R2=0.9996,說明沒食子酸對照品在0.8020～4.9150 μg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.2.7.2 供試品溶液的制備及其多酚含量的計算 稱量1.0008 g北五味子鮮果果汁凍干粉末和1.0005 g發酵后凍干粉末,加入蒸餾水25 mL,超聲(40 kHz、30 ℃)提取1.5 h,過濾,續濾液定容至25 mL即為供試品溶液。精密吸取發酵前后的供試品溶液各0.5 mL,按照1.2.7.1中的方法處理后,以不含樣品溶液為空白對照,測定其在760 nm波長下的吸光度值,并根據標準曲線方程計算鮮果和發酵物中多酚的含量,該實驗平行三次,測定結果以平均值計。

1.2.8 黃酮含量測定方法

1.2.8.1 標準曲線的建立 精密稱量蘆丁對照品,用60%甲醇稀釋至刻度,配成濃度為10.42 μg/mL的對照品溶液,分別精密量取0.1、0.4、1.0、2.0、3.0和4.5 mL對照品溶液,繪制標準曲線[19-22]。建立回歸方程為y=0.01203x+0.0592,R2=0.9997,說明蘆丁對照品在1.042～46.89 μg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.2.8.2 供試品溶液的制備及其黃酮含量的計算 分別稱量1.0008 g北五味子鮮果果汁凍干粉末和1.0005 g發酵后凍干粉末,加入60%甲醇25 mL,超聲(40 kHz、30 ℃)提取1.5 h,補足失重,過濾即為供試品溶液;精密吸取發酵前后供試品溶液各5 mL,按照1.2.8.1中的方法處理后,以相應試劑為空白對照,測定在510 nm波長下的吸光度值,并根據標準曲線方程計算鮮果和發酵物中黃酮的含量,該實驗平行三次,測定結果以平均值計。

1.2.9 發酵前后北五味子果汁對酒精肝大鼠模型中AST和ALT活力的影響

1.2.9.1 分組及給藥 將50只大鼠按體重隨機分為5組,每組10只,即空白對照組(正常組)、模型對照組(酒精肝損傷模型組)、北五味子鮮果組、北五味子發酵組及陽性對照組(聯苯雙酯組)。

將空白對照組和模型對照組灌胃等體積的生理鹽水,鮮果組和發酵組均按大鼠體重200 mg/kg進行灌胃,連續給藥7 d,于給藥第6 d晚上禁食,末次給藥1 h后,除空白對照組外,其余各組均按12 mL/kg灌胃50%乙醇溶液,造成急性酒精肝損傷。

1.2.9.2 血清采樣檢測 末次給藥后8 h,處死大鼠,解剖取肝臟。將各組動物腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg進行麻醉,腹主動脈采血6 mL,分離血清,注入干凈的采血試管內,4 ℃、2000 r/min,離心10 min,分離血清,按照天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒說明書比色法測定。

1.2.9.3 組織采樣檢測 取肝臟組織塊(0.2～1.0 g),用冰冷的生理鹽水清洗,濾紙拭干,稱重,剪碎,置于玻璃勻漿器中,加入冰生理鹽水制成10%的組織勻漿,3000 r/min,離心15 min,取上清液,稀釋為10%的組織勻漿,按照天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒說明書比色法測定。

1.3 數據處理

所有實驗數據以平均數±標準平均誤差(Means±SD)表示。差異顯著性檢驗采用GraphPad Prism 6統計軟件進行單因素方差分析。以P<0.01作為具有極顯著性差異,P<0.05為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 果汁生物降酸工藝研究單因素實驗

2.1.1 發酵時間的考察 經過測定,高壓滅菌之后的北五味子果汁pH≈1.8,在這種強酸環境下,靈芝菌的生長會受到一定程度的抑制。靈芝菌在北五味子果汁中的發酵狀況以及不同發酵時間靈芝菌的代謝活動對北五味子果汁pH的影響如圖1所示。

圖1 發酵時間對果汁pH的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the pH value of juice

通過靈芝菌的生物發酵,北五味子果汁的pH得到了顯著的改善,從0～6 d,果汁的pH迅速提高,可能是正處于靈芝菌的對數生長期,菌絲體生長代謝旺盛而引起的。從第6 d開始,果汁pH變化趨于緩和,到達第12 d后pH基本保持不變,所以確定最佳發酵時間為12 d。

2.1.2 接種量的考察 初始接種量大,利于菌種適應新的培養環境,加快生物量累計的效率,然而,菌種的生長與特定物質的代謝并不一定呈正相關性,且接種量過大,會消耗北五味子果汁中大量的營養物質,降低北五味子發酵果汁的營養附加值,因此,考察接種量是生物降酸工藝摸索的重要環節之一。

由圖2可知,當初始接種量位于2.5%～5.0%之間時,靈芝菌對北五味子果汁中的酸性物質代謝速率隨著接種量的增加迅速提高,pH上升幅度較大,在接種量5%時達到峰值,之后pH維持一個相對穩定的狀態,所以選擇接種量4%、5%、6%進行后續的優化實驗。

圖2 接種量對果汁pH的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on the pH value of juice

2.1.3 菌齡的考察 微生物在新培養環境中的生長和代謝情況,與接種時的菌齡有很大的關聯,菌齡太短或太長均對發酵效果不利,一般來講,處于對數生長期的菌種能夠在新的培養基中快速繁殖,加快生物量的積累和代謝反應的發生[23]。因此本實驗選擇一定菌齡范圍的靈芝菌,平行接種到北五味子滅菌果汁中,考察最適的發酵菌齡,結果如圖3所示。

圖3 接種菌齡對果汁pH的影響Fig.3 Effect of inoculation age on the pH value of juice

接種菌齡小于2 d的靈芝菌在北五味子果汁中生長緩慢,發酵后果汁pH的提高幅度較低;當菌齡處于3～5 d時,發酵后的果汁pH均大于3;菌齡大于5 d后,果汁pH開始下降;考慮到實驗周期的問題,故選擇菌齡3、4、5 d進行后續優化實驗。

2.1.4 振蕩速度的考察 在微生物培養過程中,振蕩不僅可以提高微生物與培養基中營養成分的接觸幾率，使同一生物發酵體系中的微生物生長代謝進程相對均勻,而且還決定著液體培養基中的溶氧和二氧化碳濃度,因此,振蕩速度是一項非常重要的考察參數[24]。

通過圖4可以看出,當振蕩速度小于160 r/min時,靈芝菌在北五味子果汁中的發酵效率較低,pH沒有明顯的變化,當振蕩速度大于160 r/min后,發酵果汁中的pH有了一定程度的提高,并且在180 r/min達到最大值;振蕩速度在180～200 r/min時,發酵果汁中的pH明顯下降,所以選擇振蕩速度170、180、190 r/min進行后續正交試驗。

圖4 振蕩速度對果汁pH的影響Fig.4 Effect of vibration speed on the pH value of juice

圖5 維生素B1對果汁pH的影響Fig.5 Effect of VB1 on the pH value of juice

2.2 果汁生物降酸工藝研究正交試驗

由表2和表3可知,接種量(A)的變化對實驗結果的影響最為顯著,最終確定北五味子果汁生物發酵降酸工藝的最佳條件為A3B3C1D3,即:接種量為6%(V/V);維生素B1的加入量為10 mg/L;接種菌齡為3 d的靈芝菌;搖床振蕩速度為190 r/min。

表2 正交分析表Table 2 Orthogonal analysis

表3 L9(34)正交試驗方差分析結果表Table 3 Variation analysis of L9(34)orthogonal tests

2.3 發酵工藝驗證

稱取北五味子鮮果汁凍干粉1 g,加入20 mL蒸餾水,0.2 mg維生素B1,121 ℃滅菌20 min,按6%(V/V)的接種量接種菌齡3 d的靈芝菌,在190 r/min、28 ℃的恒溫搖床中培養12 d,測定pH和滴定酸度變化,該實驗平行三次,結果見圖6。三批試驗菌體pH之間無明顯差異,發酵后的pH范圍穩定在3.18～3.22之間,通過靈芝菌的生物發酵,北五味子果汁的滴定酸度下降了53.7%。

圖6 生物降酸工藝驗證結果Fig.6 Verification results for deacidification process

2.4 果汁發酵產物主要活性成分的含量測定

通過對多糖、黃酮、多酚的含量進行測定結果見表4,發現果汁經過發酵之后多糖的含量提高了61.5%,而多酚和黃酮的含量分別降低了64.2%和50.6%。在靈芝菌液體發酵過程中,多糖是其最重要的代謝產物之一,因此,果汁中多糖含量的升高可能與靈芝多糖的合成與分泌有關[26];另一方面,據文獻報道,靈芝菌在發酵過程中分泌的漆酶可以氧化并生物降解苯酚和黃酮等多酚類化合物,在本實驗中,這可能是導致北五味子果汁中該類成分含量下降的主要原因[27]。

表4 果汁發酵前后主要成分含量變化表Table 4 Contents variation of major components in juice before and after fermentation

2.5 發酵前后北五味子果汁對大鼠酒精肝損傷的保護作用比較

2.5.1 血清及組織ALT測定結果 如表5所示，與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性極顯著增加(P<0.01);與模型對照組相比,北五味子鮮果組、北五味子發酵組及陽性對照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01);與北五味子鮮果組相比,北五味子發酵組及陽性對照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性顯著降低(P<0.05)。

表5 酒精性肝損傷大鼠血清及肝組織 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性Table 5 ALT activity in serum and liver tissue of alcohol-induced rat model of liver

注:與模型對照組比較,*代表差異顯著,P<0.05,**代表差異極顯著P<0.01;與五味子鮮果組比較,Δ表示差異顯著,P<0.05;表6同。

表6 酒精性肝損傷大鼠血清及肝組織 天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活性Table 6 AST activity in serum and liver tissue of alcohol-induced rat model of liver

2.5.2 血清及肝組織AST測定結果 如表6,與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性極顯著增加(P<0.01);與模型對照組相比,北五味子鮮果組、北五味子發酵組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性顯著降低(P<0.05),陽性對照組極顯著降低(P<0.01);與北五味子鮮果組相比,北五味子發酵組及陽性對照組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性顯著降低(P<0.05)。

有研究表明[28],機體的脂質過氧化和氧化應激與酒精性肝病的發病機制密切相關。肝細胞膜脂質過氧化,會損傷細胞膜的結構和功能,導致細胞腫脹破損,釋放出丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)。ALT幾乎全部存在于肝內,絕大部分分布在肝細胞的細胞漿中,所以當肝細胞受損,細胞膜通透性增加使肝細胞中的ALT釋放到血液中,引起血清ALT升高。而AST主要分布在肝臟肝細胞漿和線粒體中。在正常情況下,僅有極少量ALT和AST釋放到血液中,因此在血清中活性很低;當肝細胞受損時,這兩種酶大量釋放入血,使得血清中ALT和AST活性顯著增高[29]。因此,AST、ALT等指標水平的變化成為臨床上評價肝損傷最常用的重要指標[30]。

實驗使用50%乙醇進行灌胃,建立大鼠急性酒精肝損傷模型,觀察北五味子果汁發酵物的保肝護肝作用。結果表明,北五味子鮮果汁組和發酵果汁組均可以顯著或極顯著的降低大鼠血清和肝臟組織中ALT和AST的活力(P<0.05或P<0.01),說明二者對酒精所致的大鼠急性肝損傷均具有一定的保護作用,且發酵組作用效果要優于鮮果組。

3 結果與討論

本研究首次將生物發酵技術應用于天然北五味子果汁的降酸工藝,一定量的北五味子果汁凍干粉末,以1∶20 (W/V)的比例加入蒸餾水,接種菌齡3 d,接種量6%(V∶V),維生素B1濃度10 mg/L,振蕩速度190 r/min,經過12 d的發酵之后將果汁的pH由1.85提高到3.21,滴定酸度從14.9 g/L降低到6.9 g/L,與原果汁相比酸度降低了53.7%,遠高于目前其他已報道的北五味子果汁降酸技術[31];通過初步的化學成分分析表明,發酵果汁中多酚和黃酮的含量大幅度下降,而這兩類成分是大多數植物中構成酸性環境的主要化學物質,據報道,引起北五味子果汁酸度過高的主要原因也是與這兩類成分相關[32],因此,這可能是北五味子果汁生物降酸的主要原因[33]。

在食品和健康產品加工過程中引入發酵環節可能會導致生物安全性等問題,因此本文中選擇的發酵菌種是衛健委規定的允許在保健食品工業上使用的藥食同源真菌,生物安全性高、遺傳穩定性好、且工藝簡便、營養成分背景清晰,在降酸的同時,果汁中多糖的含量上升約61.5%,提高了北五味子果汁的營養附加值。

在藥理活性方面,目前關于北五味子保肝護肝活性的研究主要集中于它的干燥果實及其提取物,其中主要活性物質為木脂素和多酚類化合物[34],在本研究中,多酚的含量下降較為明顯,為了探清發酵過程是否會降低北五味子果汁的保肝護肝活性,對血清和肝組織中AST和ALT的活力進行了檢測,并以此結果為依據初步表征不同實驗組的保肝護肝活性;結果表明,發酵前后的果汁均能顯著降低血清和肝臟組織中AST和ALT的活力(P<0.05),并沒有因為多酚含量的降低而產生顯著的藥理活性下降。靈芝多糖也具有良好的保肝護肝活性[35],考慮到發酵之后果汁中多糖含量的增加,推測果汁中新增的靈芝多糖類成分可能與其他活性成分起到了協同預防酒精肝損傷的作用,該部分內容需要進一步的深入研究驗證。

本文在達到降酸目的的同時,提高了北五味子獨特的保健功效,得到的北五味子降酸果汁可以作為多種保健食品和健康產品的原料進行開發;在后續的研究中,北五味子果汁發酵過程中化學成分的系統變化分析將有利于闡明其生物降酸的機理,也為其原料和產品的安全使用提供理論依據。