響應面法優化核桃乳發酵工藝

,4,*

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025; 2.貴州省鳳岡縣農牧局,貴州遵義 564200; 3.貴陽學院食品與制藥工程學院,貴州貴陽 550005; 4.貴州省果品加工工程技術研究中心,貴州貴陽 550005)

我國植物蛋白資源豐富,廉價且具有較高的營養價值和良好的理化特性,是人體所需蛋白質的主要來源之一[1]。以植物蛋白代替動物蛋白生產乳酸菌發酵飲料具有廣闊的市場前景。但從當前核桃目前的加工利用現狀來看,國內食品行業針對核桃的加工利用還僅限于初級食品的制作,產品附加值較低,并沒有將核桃的資源優勢和營養保健優勢充分利用與開發。為使核桃資源得夠綜合利用,為人類帶來更大的益處,加強對核桃的深加工,開發具有高技術含量的核桃產品十分必要[2-3]。

乳酸菌是一類能利用糖并產生大量乳酸的細菌,在其發酵食品及產物中不產生任何毒素,乳酸菌發酵最直接的作用是提高發酵食品風味和適口性[4-5],并且可產生對人體有益的成分[6]。另外,活性乳酸菌進入人體消化道內與有害菌競爭營養元素,定值在腸道中具有抑菌作用且可調節改善腸道功能[7]。

關于核桃發酵乳的研究,國外學者對發酵植物蛋白飲料研究主要集中在發酵型酸豆乳、發酵花生乳,發酵核桃乳報道較少;例如Baldwine等對豆乳中加入乳清粉發酵后的產品進行了研究[8]。Sunny-Roberts等用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種發酵花生乳[9]。國內對核桃發酵乳的研究報道較多,一般采用已有的、成熟的菌種進行發酵。

本研究采用的植物乳桿菌是前期實驗從貴州酸湯中分離得到的,具有產蛋白酶的能力的乳酸菌,其蛋白酶活力為(2.045±0.012) U/mL。本文以核桃乳作為發酵底物,探究此植物乳桿菌與使用成熟的嗜酸乳桿菌混合發酵,研發一種兼具核桃和乳酸菌發酵食品雙重優點的植物蛋白發酵飲料,為核桃深加工提供一種可行性途徑,也為拓展乳酸菌應用范圍提供一定的理論依掘。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)實驗室分離、嗜酸乳桿菌ATCC 4356(Lactobacillusacidophilus) 中科院微生物菌種保藏中心(-20 ℃甘油保存);核桃 黔產五號,畢節市陽光食品有限公司;甲醛 分析純,西隴科學股份有限公司;MRS培養基 上海博微生物科技有限公司;氨基酸混合標準品 色譜純,日本Wako株式會社。

L-880日立氨基酸自動分析儀 日本wako株式會社;SW-CJ-1G型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;CS2000高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司;D-3L高壓均質機 美國PhD科技有限公司;SPX-150Bш生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3C+pH計 成都世紀方舟科技有限公司;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵核桃乳的工藝流程 核桃仁→脫種皮→壓榨→核桃粕→粉碎→過篩(80目)→研磨→調配→均質→核桃乳→滅菌→自然冷卻→接菌→發酵→冷藏后熟

1.2.1.1 核桃乳的制備 脫種皮,先將核桃仁放置在零下18 ℃中冷凍2～3 h后取出,迅速用50～60 ℃的蒸汽噴淋15～20 min。再用50～60 ℃混合堿水[2%復合磷酸鹽(Na3PO4·12H2O∶Na2HPO4·12H2O∶Na4P2O7·10H2O=7.5∶1.5∶1)∶0.5% Na2CO3∶1% NaOH溶液=1∶1∶1]浸泡20～30 min,最后采用高壓水槍沖洗去皮,水流pH為7左右即可。采用高速粉碎機(36000 r/min)將核桃粕粉碎。核桃粕粉與水料液比按1∶8混勻后經膠體磨循環4～5次,使其更加細膩。壓榨得到的核桃粕與0.3%羧甲基纖素鈉、0.2%單硬脂酸甘油酯、0.5%蔗糖脂肪酸酯、0.5%黃原膠、15%白砂糖混合進行調配[8],得到的核桃乳經過壓力為20 Mpa高壓均質兩次后使得核桃乳口感更細膩絲滑、組織狀態均勻。121 ℃、20 min滅菌冷卻備用[10]。

1.2.1.2 菌種的活化 第一代液體培養:首先將凍藏的植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌劃線于MRS固體培養基中,待其長出單個菌落,然后挑出單個菌落接種至100 mL/瓶(250 mL錐形瓶)核桃乳(按1.2.1中配制),放置在37 ℃搖床中培養12 h;第二代液體培養:將第一代得到的菌液取出1%,添加至100 mL/瓶核桃乳中進行二代液體培養;第三代液體培養同上述操作。活菌數量趨于穩定達到107數量級[11]即可作為菌液備用。

1.2.1.3 發酵核桃乳的制備 待核桃乳冷卻后在超凈臺中按一定比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌,在一定的溫度條件下發酵。在4 ℃條件下冷藏12 h后熟,得到成品。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 接種量對發酵核桃乳品質的影響 按照1.2.1的工藝流程制作發酵核桃乳,其中固定植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1[12],發酵時間為10 h,發酵溫度為37 ℃,考察接種量3%、4%、5%、6%、7%、8%對發酵乳飲料pH、總酸、感官評定得分的影響。

1.2.2.2 菌種配比對發酵核桃乳品質的影響 按照1.2.1的工藝流程制作發酵核桃乳,其中接種量為6%,發酵時間為10 h,發酵溫度為37 ℃[13],考察菌種配比植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1對發酵乳飲料pH、總酸、感官評定得分的影響。

1.2.2.3 發酵時間對發酵核桃乳品質的影響 按照1.2.1的工藝流程制作發酵核桃乳,其中固定接種量為6%[14],植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1,發酵溫度為37 ℃,考察發酵時間6、8、10、12、14 h對發酵乳飲料pH、總酸、感官評定得分的影響。

1.2.2.4 發酵溫度對發酵核桃乳品質的影響 按照1.2.1的工藝流程制作發酵核桃乳,其中固定接種量為6%,植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1,發酵時間10 h,考察發酵溫度35、37、39、41、43 ℃對發酵乳飲料pH、總酸、感官評定得分的影響。

1.2.3 Box-Behnken中心組合試驗設計 以單因素實驗為參考,采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理,選取接種量、菌種比例、發酵時間及發酵溫度4個因素,模糊數學感官評分為評價指標。分別以A、B、C、D為代表,每一個自變量的低中高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼,采用4因素3水平實驗設計,優化發酵核桃乳工藝。響應面設計實驗因素及水平見表1。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria

表1 響應面設計因素及水平Table 1 Response surface design factors and levels

1.2.4 優化指標的測定

1.2.4.1 總酸 參照GB/T 12456-2008食品總酸的測定。

1.2.4.2 pH 采用數顯pH計測定。

1.2.4.3 感官評價 邀請10名專家(男∶女=1∶1)組成感官評定小組,要求評價員評定前12 h內不得飲酒,不食刺激性食物,評定過程嚴禁互相探討,樣品盛裝一樣的容器中,編號隨機,每評定一份樣品用清水漱口,依次對樣品進行評價,100分為滿分[15-16],發酵核桃乳感官評定標準見表2。

感官評價模糊數學模型的建立:以色澤、香氣、滋味、組織形態為因素集,以優、良、中、差為評語集,根據感官評定結果,建立4個單因素評價矩陣,用模糊數學評價方法對其進行分析[17]。

建立評判集:對發酵得到的核桃粕乳樣品進行編號,根據表1對發酵核桃粕乳的品質進行模糊數學綜合評判,并建立評判集。因素集U={色澤u1,香氣u2,滋味u3,組織形態u4};評語集V={好、較好、一般、較差}[18];

權重的確定:權重集X={0.25,0.25,0.30,0.20},即色澤25分,香氣25分,滋味30分,組織形態20分,共100分[19-20]。

模糊關系綜合評集:模糊關系綜合評判集Y=X×R,其中X為權重集,R為模糊矩陣。加權綜合性評分法:取實驗的考察指標為因素,則因素集U={U1,U2},其各因素隸書函數,如下:U1i=(Y1i-Y1 min)/(Y1 max-Y1 min)選取評價函數為D1=a1U1i+a2U2i式中a1,a2權重系數[21]。

1.2.5 產品品質指標的測定

1.2.5.1 氨基酸 參考GB 5009.124-2016食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定,依據出峰時間、峰面積對氨基酸進行定性、定量分析。

1.2.5.2 氨基酸態氮含量 參照GB 5009.235-2016食品中氨基酸態氮的測定。

1.2.5.3 蛋白質 參照GB 5009.1-2016食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定。

1.2.5.4 乳酸活菌數的測定 參照GB 4789.35-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗。

1.3 數據處理

實驗重復3次,結果采用平均值±標準差形式表示,單因素實驗采用origin 8.6和Excel進行數據處理。響應面實驗采用Design Expert 8.0.6進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 接種量對發酵乳品質的影響 由圖1可以看出,隨著接種量的增加,pH呈先降低后升高的趨勢，總酸及感觀評分呈先升高后降低的趨勢,當接種量為7%時pH達到最低,總酸含量最高,說明菌的產酸能力增強,且能夠適應較酸的環境,感官評分也最高為81分,其組織均勻細膩,色澤和滋味均較好;接種量為6%、8%的發酵乳組織狀態以及色澤均較好,感官評分較高。綜上所述,選取接種量6%、7%、8%作為響應面試驗參數。

圖1 接種量對發酵核桃乳總酸含量、 感官評分及pH的影響Fig.1 Effects of inoculation on the total acid contents, sensory scores and pH of fermented walnut milk

2.1.2 菌種配比對發酵核桃乳品質的影響 菌種比例1∶1時，pH最低，總酸最高，感官評分也是最高，總酸高有利于發酵奶的凝固，不易裂開。另外，實驗中發現菌種比例1∶1、1∶2和1∶3的發酵乳組織狀態、氣味和色澤很好，感官評分分別為81、80、75。其余條件下的發酵乳雖然組織結構、氣味和色澤均不錯,但是有少量乳清析出,感觀評分也低于上述三個菌種配比,在響應面試驗中菌種配比選取 1∶1、1∶2與1∶3。

圖2 菌種配比對發酵核桃乳總酸含量、 感官評分及pH的影響Fig.2 Effect of strain ratio on the total acid contents,sensory scores and pH of fermented walnut milk

2.1.3 發酵時間對發酵核桃乳品質的影響 由圖3可以看出,隨著發酵時間的增加,發酵核桃乳的總酸含量不斷上升。當發酵時間為6 h時凝乳不完全,組織疏松;發酵時間達到12 h時凝乳,并且組織均勻、細膩、表面光滑、無氣泡,總酸含量為19.62 g/kg;而發酵時間為10、14 h的發酵乳，凝固較好,香味也較濃郁,此時的總酸含量分別為16.68、19.63 g/kg;而發酵時間低于10 h的發酵核桃乳組織較疏松,凝乳不全,核桃乳香氣不足。因此，在響應面試驗中發酵時間選取10、12、14 h。

圖3 發酵時間對發酵核桃乳總酸含量、 感官評分及pH的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the total acid contents, sensory score and pH of fermented walnut milk

2.1.4 發酵溫度對發酵核桃乳品質的影響 由圖4可看出,當發酵溫度為37 ℃時，此時發酵核桃乳有小部分凝乳不完全，但發酵乳滋氣味相對較好。當發酵溫度為43 ℃時，有大量乳清析出，固有滋味、氣味不濃郁，凝固較差。發酵溫度為39 ℃的發酵核桃乳,組織均勻細膩,并且表面光滑,固有滋味非常濃郁,其評分最高為82.5。固選取37、39和41 ℃作為響應面實驗參數。

圖4 發酵溫度對發酵核桃乳總酸含量、 感官評分及pH的影響Fig.4 Effect of temperature on the total acid contents, sensory score and pH of fermented walnut milk

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 模糊數學感官評定 以試樣1的發酵核桃乳樣為例,可建立色澤、香氣、滋味和組織狀態4個單因素的模糊評價矩陣:A色澤=[0.6 0.4 0.0 0.0],A滋味=[0.1 0.4 0.5 0.0],A香氣=[0.0 0.4 0.4 0.2],A組織狀態=[0.7 0.2 0.1 0.0]。把上述對1號樣品的4個單因素評價結果寫成一個模糊矩陣:

2.2.1.1 模糊關系綜合評判集:

其中,Y11=(0.25^0.6)∨(0.30^0.1)∨(0.25^0.0)∨(0.2^0.7)=0.25,處理后可得Y1=(0.25 0.3 0.25 0.2),同理可得Y2-Y29。

2.2.1.2 模糊綜合評判結果 設定感官特殊性:優為100分,良為80分,中為60分,差為40分可建立感官特殊性數集V=(100 80 60 40),則樣品的模糊綜合評判總分為T=Y×V,得到1號核桃粕乳T1=(0.35 0.30 0.12 0.23)×(100 80 60 40)=75分;同理得編號為T2～T29的發酵核桃乳模糊綜合評判結果[22]。

2.2.2 響應面試驗結果

2.2.3 回歸分析擬合及方差分析 響應面結果見表3，運用Box-beheken響應面分析法對實驗結果擬合的模型進行方差分析[23-25],模型中各系數顯著性檢驗結果見表4,該模型的F值為16.65,大于0.01水平上的F值,且P<0.0001,說明該模型極顯著,該模型的決定系數R2=94.39%,說明該模型的擬合度良好,能夠預測響應值。在統計學上有意義,失擬項F=2.59,P=0.1861>0.05,不顯著,說明該模型回歸方程不失擬,能充分反映實際情況,可以用回歸方程代替試驗真實點對實驗結果進行分析。復相關系數越大,表明變量之間的線性關系程度越密切。各因素中,一項A、B、C、D,二次項C2、D2,交互項AB、AC、AD、BD、CD對發酵核桃乳感官評分均影響顯著(P<0.05或P<0.01)。由F值可知,各因素對發酵核桃乳感官評分影響程度依次為接種量=發酵時間>菌種配比(植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌)>發酵溫度。圖5～圖14為兩兩因素交互作用對響應值的影響。由圖5～圖14可知,AB、AC、AD、BD、CD響應面圖的曲面坡度較為陡峭,等高線分布較為密集,說明此兩因素間的交互作用對響應值具有顯著影響。

表3 響應面優化試驗設計及試驗結果Table 3 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

表4 感官評分回歸分析結果Table 4 Regression analysis of sensory score

注:*表示差異顯著,即P<0.05,**表示差異極顯著,即P<0.01。

圖5 Y=f(A,B)響應面圖Fig.5 Response surface of Y=f(A,C)

圖6 Y=f(A,B)等高線圖Fig.6 contour of Y=f(A,B)

圖7 Y=f(A,C)響應面圖Fig.7 Response surface of Y=f(A,C)

圖8 Y=f(A,C)等高線圖Fig.8 Contour of Y=f(A,C)

圖9 Y=f(A,D)響應面圖Fig.9 Response surface of Y=f(A,D)

圖10 Y=f(A,D)等高線圖Fig.10 Contour of Y=f(A,D)

圖11 Y=f(B,D)響應面圖Fig.11 Response surface of Y=f(B,D)

圖12 Y=f(B,D)等高線圖 Fig.12 Contour of Y=f(B,D)

圖13 Y=f(C,D)響應面圖Fig.13 Response surface of Y=f(C,D)

圖14 Y=f(C,D)響應面圖Fig.14 Response surface of Y=f(C,D)

2.2.4 驗證性試驗 根據建立的模型通過軟件進行最優分析[26-28],在接種量8%、植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1、發酵時間:12.73 h、發酵溫度40.99 ℃時感官評分為82.5分,將上述條件簡化為接種量8%、植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1、發酵時間:12.7 h、發酵溫度41 ℃,實際得到的感官評分為85分,誤差率為2.94%,因此確定上述模型可靠具有參考性。

2.2.5 氨基酸含量測定結果 測定最佳工藝條件下發酵的核桃乳氨基酸含量與未發酵的核桃乳相比,氨基酸標準品分析圖譜如下圖15,未發酵核桃乳氨基酸含量圖譜如下圖16,發酵核桃乳氨基酸含量如下圖17。

圖15 氨基酸標準品圖譜Fig.15 Amino acids contents map of fermented walnut milk

圖16 未發酵核桃乳氨基酸含量圖譜Fig.16 Amino acids contents map of fermented walnut milk

圖17 發酵核桃乳氨基酸含量圖譜Fig.17 Amino acids contents map of fermented walnut milk

將未發酵的核桃乳與優化發酵工藝后的核桃乳氨基酸含量進行對比,結果如表5所示。

由表5可知發酵核桃乳與未發酵的核桃乳相比,檢測出蛋氨酸和酪氨酸,與未發酵核桃乳對比，除了半胱氨酸減少以外,其他氨基酸都有不同程度的增加,夏君霞等[29]研究的益生菌發酵純核桃乳,其中8種必需氨基酸含量均有不同程度的增加,而本文研究的有15種氨基酸都有不同程度的增加,可能是因為菌種發酵產生蛋白酶使得核桃中的大分子蛋白質分解成小分子的肽或是氨基酸。

表5 各氨基酸含量對比Table 5 Comparison of the contents of amino acids

2.2.6 產品品質指標測定結果 在最佳工藝條件下得到的核桃乳進行理化指標的測定,對于益生菌發酵核桃乳目前暫時未查到相關國家標準,參考GB 7101-2015 《食品安全 國家標準 飲料》和QB/T 4222-2011 《復合蛋白飲料標準》,要求活菌型(未殺菌)產品乳酸菌活菌數≥106cfu/g(mL),本發酵乳活菌數為7.78×108cfu/g(mL),蛋白質含量≥0.7 g/100 g,本發酵乳蛋白質含量為1.05 g/100 g,微生物限量、感官要求符合GB 7101-2015《食品安全 國家標準 飲料》,微生物限量符合GB 4789.26-2013,目前對氨基酸含量未做出要求,本發酵乳氨基酸含量為1.3586%,未發酵的核桃乳氨基酸含量為1.1848%，發酵核桃乳氨基酸較未發酵的提高了0.1738%，氨基酸態氮68.6 mg/100 g，pH為3.88，總酸含量為25.63 g/kg。

3 結論

通過響應面試驗,結合實際生產確定發酵乳最佳發酵工藝條件為:接種量8%,植物乳桿菌乳桿菌∶嗜酸乳桿菌菌=1∶1,發酵時間12.7 h,發酵溫度41 ℃。感官評分85分,后熟12 h乳酸菌活菌數為7.78×108cfu/mL,pH和總酸分別為3.88與25.63 g/kg,氨基酸態氮68.6 mg/100 g,蛋白質含量1.05 g/100 g,在此生產條件下生產的發酵核桃乳組織狀態均勻細膩,酸度適中,氣味濃郁,口感及品質均得到提升,本文研究發現發酵核桃乳氨基酸含量為1.3586%，與未發酵的相比，氨基酸總含量提高0.1738%,該實驗方法得到的最佳生產工藝參數真實可靠。