發酵對黃精主要活性成分及其抗氧化活性和刺激性的影響

楊婧娟,張 希,馬雅鴿,楊 薇,陳 偉,杜雯霞,趙聲蘭

(云南中醫藥大學,云南昆明 650500)

黃精為百合科黃精屬多年生草本植物,是我國藥食兩用資源。黃精含有黃精多糖、皂苷、黃酮、生物堿等活性成分,具有抗氧化、抗炎、調節血糖血脂、提高免疫和腫瘤抑制等作用[1]。但生黃精對咽喉、皮膚等有刺激性,食用時有口舌麻木感,因此,黃精一般經加工后使用,近年來在食品行業的開發應用越來越廣泛。黃精的傳統加工方法以蒸煮法為主,包括單蒸、重蒸、加輔料蒸等,如目前市場上推出的即食黃精為九蒸九曬加工所得,直接食用或泡水泡茶,口感大大改善。然而,由于黃精中含有較多糖類成分,傳統加工方法長時間的高溫加熱會因美拉德反應產生過多5-羥甲基糠醛,研究顯示該成分對人體橫紋肌和內臟有毒副作用[2]。因此,尋找更有效的方法合理加工黃精具有重要意義。

應用微生物發酵天然植物資源可改變原料活性或降低其毒副作用。發酵過程反應條件溫和,而且在微生物代謝產酶作用下,可起到破壁促進活性物質溶出或實現對底物某些活性成分的結構修飾和轉化作用[3-5]。有研究顯示應用黑曲霉發酵虎杖可轉化虎杖苷為白藜蘆醇[6];茵陳蒿葉被靈芝菌固態發酵后抗炎癥作用顯著增強[7];以釀酒酵母和赤紅曲霉共發酵番石榴后,番石榴榭皮素和總酚含量及抗氧化活性顯著提高[8];蕨菜以木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌發酵后抗炎作用也得到增強[9]。發酵可降解原料中的毒性成分或將其轉化為低毒物質,如銀杏葉經發酵后銀杏酸被分解與轉化,毒副作用減弱[10]。此外,植物資源作為底物可誘導微生物產生有益次級代謝產物如真菌多糖、紅曲Monacolin類化合物[11]等起到協同增效作用的物質。

本研究應用前期實驗篩選出的藥(食)用菌凸圓靈芝固態發酵生黃精,比較發酵前后其抗氧化活性及刺激性的差異,并探討這些變化與發酵引起主要活性成分改變的聯系,為發酵法進一步應用于黃精加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精根莖 50 ℃干燥,粉碎后過40目篩備用,云南新世紀藥業有限公司;凸圓靈芝(白芝)GIM5.6 廣東省微生物菌種保藏中心(接種于玉米粉20 g/L、麩皮10 g/L、豆粕10 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO41 g/L的液體培養基中,150 r/min,28 ℃培養7 d制成液體種子備用);HUVEC人臍靜脈內皮細胞、SIRC兔角膜上皮細胞 華拓生物科技有限公司;高糖DMEM培養基 美國Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青試劑公司;胰蛋白酶、雙抗、人參皂苷Rb1北京索萊寶科技有限公司;所用其他試劑 均為分析純。

SW-CJ-2D型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;INFINITE M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan;LRH-250生化培養箱 上海醫療器械五廠;CO2培養箱311型 美國Thermo Fisher;倒置顯微鏡CKX31 日本Olympus;高效液相色譜儀、Thermo ODS-2 C18柱(4. 6 mm×250 mm,5 μm) 安捷倫1260 Infinity II。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精的加工 發酵法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精與輔料小麥麩皮按照質量比3∶1比例混勻后滅菌備用(121 ℃滅菌20 min),在無菌條件下接種10%凸圓靈芝液體種子,于28 ℃固態發酵12 d,60 ℃干燥12 h即得黃精發酵樣。取5 g發酵樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存備用。

蒸制法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精,用蒸餾水按料水比1∶20浸潤6 h后取出,置于蒸鍋中蒸制6 h,停火燜潤6 h,60 ℃干燥12 h即得黃精蒸制樣[12]。取5 g蒸制樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存備用。

酒制法加工黃精:取一定量干燥粉碎生黃精,按每100 kg黃精用20 kg黃酒的比例,將其悶潤直至酒吸盡,置于蒸鍋中蒸10 h,60 ℃干燥12 h即得黃精酒制樣[13]。取5 g酒制樣以蒸餾水按1∶20料水比95 ℃回流浸提,收集上清液,定容至250 mL,于4 ℃保存備用

1.2.2 黃精的抗氧化活性測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 取1.2.1加工所得不同黃精樣液，參照文獻[14]中DPPH法測定抗氧化能力。設不同質量濃度(0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL)抗壞血酸(VC)同法操作,以VC濃度為橫坐標,DPPH自由基清除率為縱坐標繪制標準曲線(y=15.45x+0.3335,R2=0.9935),計算樣品的VC當量抗氧化能力(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity,AEAC)。

1.2.2.2 鐵離子還原能力的測定 取1.2.1加工所得不同黃精樣液，參照文獻[15]中鐵離子還原能力法測定抗氧化能力。設不同質量濃度(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)VC同法操作,以VC濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(y=6.5815X+0.0304,R2=0.9972),計算樣品的VC當量抗氧化能力(AEAC)。

1.2.2.3 氧化損傷的HUVEC的保護作用 利用過氧化氫建立人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)氧化損傷模型評價黃精的抗氧化作用[16]。取對數生長期的HUVEC細胞,以105個/孔細胞密度接種于96孔板,37 ℃,CO2培養約24 h。將細胞分為正常對照組:用完全培養液(89%高糖DMEM培養液+10%胎牛血清+1%雙抗)培養細胞,每隔24 h換1次液;過氧化氫氧化損傷組:以完全培養液繼續培養24 h后，加入H2O2溶液使其在孔內終濃度為1.1 mmol/L(建模實驗篩選濃度),誘導損傷4 h;黃精樣品組:預先加入1.2.1加工黃精樣品(調整樣液在孔內濃度為原料質量濃度10 mg/mL)培育24 h后,再加入1.1 mmol/L H2O2誘導損傷4 h。MTS法檢測細胞存活率。

1.2.3 黃精的刺激性評價實驗 應用兔角膜上皮細胞(SIRC)短時暴露法評價黃精的刺激性[17-18]。選擇具有明確眼刺激性的十二烷基硫酸鈉(SDS,5 mg/mL)為陽性對照,甘油(10 mg/mL)為陰性對照。取對數生長期SIRC細胞,以105個/孔的細胞密度接種于96孔板,每孔100 μL,待細胞生長融合后,用SDS、甘油和1.2.1不同加工方法所得黃精樣品(原料質量濃度10 mg/mL)分別處理細胞5 min,每個樣品做6個復孔。除去樣品后用PBS洗3次,每孔中加入100 μL H-DMEM培養基和10 μL MTS溶液,放入37 ℃ CO2培養箱中培養3 h左右,于490 nm測定吸光度,計算細胞存活率。

1.2.4 黃精主要活性成分提取及含量測定 黃精多糖提取及含量測定:以葡萄糖為標準品,按苯酚硫酸法[19]操作繪制標準曲線(y=45.238x-0.0444,R2=0.9975)。取加工黃精樣品,按料液比1∶10 (w/v)加入80%乙醇70 ℃回流提取1次(1 h),過濾后濾渣加入10倍量蒸餾水95 ℃回流提取1次(1 h),過濾收集上清液,濾渣再加入7倍量蒸餾水重復提取1 h,收集上清液,合并兩次水提液,減壓濃縮至原體積1/10,加入乙醇使含醇量達75%,于4 ℃放置過夜,3000 r/min離心10 min收集沉淀,依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗,將洗滌處理后的沉淀于40 ℃烘干,即得黃精多糖粗提物。將不同加工黃精樣品按上述步驟制備多糖粗提物后用熱蒸餾水定容至100 mL同標準物質測定方法操作,計算樣品中多糖含量。

多糖含量(mg/g)=nCV1V3/WV2

式中,n為測量稀釋倍數,C為根據標準曲線計算所得濃度,V1為測定反應體系總體積,V2為測定取用受試樣液體積,V3為測定樣品定容總體積,W為樣品稱量質量。

黃精皂苷提取及含量測定:以人參皂苷Rb1為標準品,按香草醛高氯酸比色法[20]操作,繪制標準曲線(y=254.45x-0.0332,R2=0.9952)。取加工黃精樣品按料液比1∶10 (w/v)加入80%乙醇70 ℃回流提取1 h,重復提取2次后3000 r/min離心10 min收集上清液,減壓濃縮成固形物,用蒸餾水溶解后按1∶1的體積比用水飽和正丁醇萃取3次,取正丁醇相收集減壓濃縮成固形物為黃精皂苷粗提物。取0.5 g皂苷粗提物用甲醇定容至100 mL同標準物質測定方法操作,計算樣品中皂苷含量。

皂苷含量(mg/g)=nCV1V3/WV2

式中,n為測量稀釋倍數,C為根據標準曲線計算所得濃度,V1為測定反應體系總體積,V2為測定取用受試樣液體積,V3為測定樣品定容總體積,W為樣品稱量質量。

黃精多糖組分含量分析:以混合單糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、巖藻糖)為標準參照物質,按照文獻[21]采用柱前PMP衍生化HPLC法分析黃精多糖的單糖組成。色譜條件Thermo ODS-2 C18柱(4. 6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-0.05 mol/L pH6.7磷酸鹽緩沖液(19∶81),流速1 mL/min,檢測波長:250 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μL。

1.2.5 發酵對黃精抗氧化活性及刺激性的影響

1.2.5.1 發酵黃精多糖及皂苷粗提物的抗氧化活性評價 按照1.2.4方法制備發酵黃精多糖和皂苷粗提物,設置生黃樣、發酵樣、發酵空白對照樣、單菌對照樣進行抗氧化活性評價:分別取不同處理所得黃精多糖和皂苷樣液,按照1.2.2.1操作測定DPPH自由基清除率、按照1.2.2.2操作測定鐵離子還原力。通過上樣濃度篩選實驗后分別取黃精多糖(0.6 mg/mL)、黃精皂苷(0.4 mg/mL)按照1.2.2.3操作,評價各樣品組對HUVEC氧化損傷的保護作用。

其中,發酵空白對照樣的設置是為排除發酵過程中輔料麩皮加入對活性評價造成干擾,在黃精及輔料麩皮混合滅菌后去除“接種凸圓靈芝”步驟,其余同發酵加工法操作制備所得樣品;單菌對照樣的設置是為排除凸圓靈芝發酵產生次級代謝產物對活性評價造成干擾,以未添加黃精的麩皮基質同發酵加工法操作制備所得樣品。

1.2.5.2 發酵黃精多糖及皂苷粗提物的刺激性評價 按照1.2.4方法制備發酵黃精多糖和皂苷粗提物,為排除發酵過程中輔料麩皮加入和凸圓靈芝發酵代謝產物對黃精刺激性評價造成的干擾,同1.2.5.1設置生黃精、發酵黃精、發酵空白對照樣(黃精+麩皮輔料,但不接種藥用菌發酵)、單菌對照樣(輔料麩皮+凸圓靈芝單獨發酵),同時,以十二烷基硫酸鈉(SDS,5 mg/mL)為陽性對照,甘油(5 mg/mL)為陰性對照,取各樣品組黃精多糖和皂苷粗提物(5 mg/mL)按照1.2.3操作進行刺激性評價。

1.3 數據處理

每個試驗至少獨立重復3次,數據以均數±標準差表示。使用SPSS 20.0軟件對數據進行統計處理(ANOVA,Dunnett’s method),*表示具有顯著性差異(P<0.05),**表示具有極顯著性差異(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 不同加工方法的黃精的抗氧化活性

由表1測定結果可知,黃精經過加工后抗氧化活性發生了改變。其中,黃精對DPPH自由基的清除能力在經過各種方法加工后均得到了提高,且蒸制法效果較好。發酵法加工黃精后其鐵離子還原力得到了提高,蒸制及酒制黃精反而顯示出還原能力的降低,這可能與不同加工方法造成黃精中的主要活性成分如多糖、皂苷含量及其組分比例改變差異有關[13]。生黃精和加工所得黃精對氧化損傷的HUVEC細胞均有一定保護作用,但蒸制和發酵黃精的保護效果較好。其中,相比于生黃精組,發酵處理組的保護作用提高達顯著水平(P<0.05),HUVEC經發酵黃精處理后對過氧化氫氧化損傷有良好的預防作用,細胞存活率提高到78.13%±4.25%,且效果優于蒸制和酒制加工樣品。出現該趨勢主要跟發酵處理伴隨的生物轉化作用及可能產生某些活性代謝產物有關[22]。綜合三項考察指標,發酵法加工對提高黃精抗氧化活性更具優勢。

表1 不同加工方法所得黃精的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of Polygonati sibiricum treated by different methods

注:HUVEC過氧化氫氧化損傷模型組的細胞存活率為54.66%±4.12%;同列不同上標字母表示數據差異顯著,P<0.05。

2.2 不同加工方法的黃精的刺激性

圖1結果顯示,相比于甘油(陰性對照),生黃精表現出一定程度的刺激性,但SIRC細胞存活率顯著高于SDS(陽性對照)。蒸制、酒制和發酵加工后黃精刺激性均有改善。其中,相比生黃精處理組SIRC細胞存活率(68.55%±5.23%),發酵樣細胞存活率提高到90.60%±3.55%,說明發酵處理能顯著(P<0.05)降低生黃精的刺激性,在三種加工方法中刺激性改善效果最顯著。

圖1 不同加工方法所得黃精的刺激性Fig.1 Irritation of Polygonatum sibiricum treated by different methods注:不同上標字母表示數據差異顯著,P<0.05。

2.3 不同方法加工的黃精中主要活性成分含量測定結果

如圖2結果顯示,傳統熱加工為主的方法與發酵法處理后黃精中的多糖及皂苷含量均有所下降。相比于生黃精,傳統蒸制和酒制加工后出現活性物質含量減少的主要原因是由于較長時間的高溫蒸制,會引起其中活性成分一定程度的分解,而且伴隨蒸氣冷凝后的流失也會帶走部分活性物質,造成多糖和皂苷含量減少相對較多。發酵加工引起的成分變化相對復雜。由于底物中加入促進菌體生長的輔料麩皮中含有一定多糖成分,因此相比于生黃精,發酵前原底物多糖含量先增加,但發酵過程微生物作用下對活性成分有分解或轉化作用會引起含量減少,而藥用菌代謝可能會產生出新的活性物質如真菌多糖或皂苷成分,對相應活性物質含量變化產生一定影響[23]。

圖2 不同加工方法所得黃精多糖及皂苷含量Fig.2 Concentation of total polysaccharide and and saponins of Polygonatum sibiricum treated by different methods注：不同小寫字母表示同一指標不同樣品間 數據差異顯著(P<0.05)。

另外,不同的加工方法除了引起黃精中多糖和皂苷總含量的變化外,還會對這些活性成分的組分造成影響。實驗選擇多糖中常見組分葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖等為單糖標準參照物質(圖3),分析了黃精加工物中多糖的構成組分,結果見表2。

圖3 標準混合單糖的HPLC圖Fig.3 HPLC spectrogram of standard mixed monosaccharide

表2 不同加工方法所得黃精總多糖粗提物的單糖組分含量(mg/g固形物)Table 2 Contents of monosaccharide components in total polysaccharide and of Polygonatum sibiricum treated by different methods(mg/gsolids)

表3 不同處理組多糖粗提物和皂苷粗提物的抗氧化能力Table 3 Antioxidant activities of polysaccharide and and saponins from different samples

注:HUVEC過氧化氫氧化損傷模型組的細胞存活率為57.02%±3.71%;同列不同上標字母表示數據差異顯著,P<0.05。

由HPLC實驗結果可知,生黃精多糖中含量最高的單糖組分為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。三種方法加工后所得多糖粗提物中甘露糖和阿拉伯糖含量均減少;蒸制和酒制加工引起半乳糖含量增加,而發酵處理后該成分含量降低。相比生黃精和傳統加工方法,發酵處理后多糖組分變化最大的區別即是鼠李糖含量增加,半乳糖醛酸含量減少;此外,生黃精中含量極少的核糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖在發酵樣中含量均較高。參照發酵空白組和單菌發酵組的測試結果,推測發酵組鼠李糖組分含量的增加并不是由生黃精和麩皮組分、菌代謝物的簡單疊加引起的,因為單菌對照樣中該單糖含量僅為(0.89±0.01) mg/g,而發酵樣中為(20.92±0.00) mg/g,發酵過程微生物引起的組分轉化是最可能原因。甘露糖6位的羥基被氫取代后得到的衍生物即為鼠李糖;半乳糖醛酸的減少可能由菌分解所致;發酵粗多糖中增加的核糖推測是由凸圓靈芝代謝產生的多糖組分[24],因為生黃精和空白對照樣中該成分含量極低。木糖和巖藻糖的升高可能跟麩皮多糖組分或菌代謝產生多糖組分的引入有關。

2.4 發酵對黃精抗氧化活性及刺激性的影響

2.4.1 發酵黃精多糖及皂苷粗提物的抗氧化活性 生黃精經發酵加工后抗氧化活性得到提高,刺激性降低,同時其中主要活性成分多糖和皂苷的總含量發生了改變,多糖組分也隨之變化。這提示黃精活性與刺激性的改變與加工引起的多糖和皂苷成分變化有一定聯系。因此,將發酵黃精中多糖和皂苷成分分離出來,分別測試其抗氧化活性及對刺激性的影響,有助于闡明其中的內在聯系。

表3實驗結果顯示,相比于生黃精,發酵黃精皂苷粗提物活性變化不明顯,而發酵黃精多糖粗提物組的DPPH自由基清除率和HUVEC存活率指標顯著(P<0.05)提高,提示黃精發酵加工后抗氧化活性的增強主要與多糖變化有關。實驗考慮到發酵底物中輔料麩皮成分及微生物代謝產物可能給活性帶來的影響,增設了發酵空白對照樣和單菌對照樣加入分析。在多糖粗提物活性測試組中,發酵空白對照樣相比生黃精樣活性略有提高,推測麩皮中的溶出物的產生或短時間高溫滅菌操作對多糖的抗氧化活性和刺激性有略微影響;單菌對照樣也顯示出一定程度的抗氧化活性,推測其為發酵黃精總活性的提高起到協同增效作用。成分分析結果顯示,發酵黃精多糖含量(121.84±2.94) mg/g相比生黃精含量(141.44±2.25) mg/g有所減少,但抗氧化活性反而提高,這可能與發酵過程微生物對生黃精中原本的多糖組分轉化有關[25]。

生黃精多糖中含量較高的單糖組分甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖經發酵后含量減少,而鼠李糖含量增加,多糖中的這些主要組分單糖含量及相互間比例的改變,可能對多糖的活性造成影響。劉柳等[26]對從黃精中分離純化的多糖進行組分分析,發現其中的兩種多糖PSW4A和PSW2A-1均由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成,但各種類之間比例的差異卻顯示出僅有PSW4A具明顯的促進免疫功能活性。因此,發酵加工黃精抗氧化活性的提高與生黃精中原多糖組分的變化及真菌多糖等成分的引入有關。

2.4.2 發酵黃精多糖及皂苷粗提物的刺激性 由圖4結果可以看出,生黃精樣皂苷提取物處理SIRC細胞存活率為50.13%±6.35%,生黃精樣多糖提取物細胞存活率為67.21%±6.34%,黃精皂苷粗提物表現出比黃精多糖更強的刺激性,可能黃精是刺激性的最關鍵成分。經發酵后黃精多糖粗提物組及皂苷粗提物組的細胞存活率均得到提高,表明其刺激性降低。單菌對照樣對比陰性對照(甘油)顯示無刺激性,可排除輔料麩皮及微生物代謝物對刺激性的影響。空白對照樣相比生黃精樣刺激性有一定改善,可能與滅菌的短時間高溫處理造成多糖和皂苷含量少量減少有關。而發酵后刺激性減弱伴隨黃精中多糖和皂苷含量的進一步降低,尤其皂苷含量顯著降低,相對生黃精減少49.8%。

圖4 不同處理組多糖粗提物和皂苷粗提物的刺激性Fig.4 Irritation of polysaccharideand and saponins from different samples注:不同字母表示同種粗提物不同 樣品間數據差異顯著，P<0.05。

皂苷雖然具有多種功能活性,但該成分本身對黏膜有刺激性,還具有一些毒副作用[27]。有研究顯示以一定劑量茶皂苷連續灌胃處理3個月的Wistar大鼠,出現了消化道內腔明顯膨脹,賁門竇粘膜上皮組織異常增生,吼黏膜壞死,氣管糜爛的現象[28]。皂苷苷元母核的類型或苷元上連接的糖鏈不同等會對皂苷毒性大小造成影響[29]。如有研究顯示甾體皂苷C-3位糖鏈的α-1,2連接的末端鼠李糖基是其細胞毒性的重要活性片斷。利用新月彎孢霉特異性地將其定向水解后可減輕其毒副作用[30]。鐘凌云等[31]研究發現,酒蒸制黃精后其中的薯蕷皂苷元含量下降,而薯蕷皂苷元是其他許多皂苷元的前體,是否在加工處理后轉化為其他皂苷元尚未明確。這些研究提示黃精中的皂苷成分可能是關聯其刺激性的一個關鍵指標,發酵處理后引起其含量降低及皂苷組分結構改變,從而刺激性減弱。此外,生黃精加工后總多糖及一些揮發性成分如正己醛、莰烯等的減少也可能對黃精毒性降低發揮了作用,這有待進一步研究。

3 結論

研究結果顯示,發酵法相比于傳統蒸制及酒制加工方法,對提高黃精抗氧化活性及降低刺激性表現出更突出的效果。發酵黃精活性的提升主要與其中的多糖在發酵后變化有關,雖然多糖總含量降低,但多糖組分單糖相比生黃精發生了變化,含量較高的單糖組分甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖經發酵后含量減少,而鼠李糖含量顯著(P<0.05)增加,且這些單糖間的比例也發生了變化;此外,生黃精中含量極少的核糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖在發酵黃精中含量也提高。黃精刺激性主要受皂苷成分影響更大,發酵后刺激性減弱與總皂苷含量顯著(P<0.05)降低有一定聯系,其原因可能與皂苷組分含量及結構改變等有關,同時也不排除多糖及揮發性成分如正己醛、莰烯等的影響,但其具體變化有待進一步研究，實驗表明應用發酵法加工黃精反應條件溫和,能更好的保留活性成分,而且發酵過程引起活性物質發生組分轉化等可進一步提高黃精生物活性及降低其刺激性,具有重要的實際應用價值。